基因治疗技术与应用

基因治疗技术与应用授课人：授课时间：2015.1.9内容基因治疗基因治疗的应用基因缺陷病1.基因缺陷病•基因是具有遗传效应的DNA分子片段。位于染色体上，呈线性排列。基因不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代，还可以使遗传信息得到表达。人类只有一个基因组，大约有5～10万个基因。当正常单个基因的DNA碱基对排列出现异常时，如碱基对置换、增添或缺失而引起基因结构变化，称作点突变。功能基因也可能部分片段或整个丢失，从而导致基因病。•基因病主要分为单基因病和多基因病两大类。1.1单基因病•如果一种遗传病的发病仅涉及一对基因，它所导致的疾病就是单基因病。•包括以下几类：常染色体显性遗传病常染色体隐性遗传病X连锁显性遗传病X连锁隐性遗传病Y连锁遗传病1.1.1常染色体显性遗传病•常染色体显性遗传病只要有一个致病基因便会表现症状,患者的子代有50%也是患者，而且世代相传。多指并指原发性青光眼1.1.2常染色体隐性遗传病•常染色体隐性遗传病要有两个等位致病基因才会发病，患儿的父母往往都是致病基因携带者，凡是代谢性遗传病均属于常染色体隐性遗传病。苯丙酮尿症1.1.3X连锁显性遗传病•X连锁显性遗传病的致病基因位于X染色体上，男性只有一条X染色体，表现症状较重，女性有两条X染色体表现症状较轻，但女性受累者是男性的两倍。抗维生素D佝偻病1.1.4X连锁隐性遗传病•X连锁隐性遗传病传男不传女，往往母亲是携带者儿子为患者。血友病A1.1.5Y连锁遗传病•Y连锁遗传病的特点是父亲传递给儿子，女儿不发病。因Y染色体上主要有男性决定因子方面的基因，其他基因很少，故Y连锁遗传病极少见。毛耳性状1.2单基因遗传病•血红蛋白病•血浆蛋白病•结构蛋白缺陷病•受体蛋白病•膜转运蛋白病1.2.1血红蛋白病——镰状细胞贫血症1.2.2血浆蛋白病——血友病•血友病A（血友病甲），即因子Ⅷ促凝成分（Ⅷ：C）缺乏症，也称AGH缺乏症，是一种性联隐性遗传疾病，女性传递，男性发病。•血友病B（血友病乙），即因子Ⅸ缺乏症，又称PTC缺乏症、凝血活酶成分缺乏症，亦为性联隐性遗传，其发病数量较血友病A少。但本型中有出血症状的女性传递者比血友病A多见。•血友病C（血友病丙），即因子Ⅺ（FⅪ）缺乏症，又称PTA缺乏症、凝血活酶前质缺乏症。为常染色体不完全隐性遗传，男女均可患病，是一种罕见的血友病。15～20/10万男孩中有发病，此发病率在所调查的不同的种族和地域之间没有差异。发病率以血友病A最多占85%，血友病B占15%，血友病C较少见。1.2.3结构蛋白缺陷病——Ehlers-Danlos综合症•COL5A1基因的22号内含子发生剪切突变1.2.4受体蛋白病——家族性高胆固醇血症•家族性高胆固醇血症是低密度脂蛋白（ＬＤＬ）受体基因突变所致的常染色体显性遗传性疾病，目前已发现的ＬＤＬ受体基因突变达１５０多个。黄色瘤角膜弓1.2.5膜转运蛋白病——先天性半乳糖吸收不良症•小肠上皮细胞转运葡萄糖、半乳糖的膜载体蛋白异常，致使葡萄糖和半乳糖吸收障碍，患者肠道内渗透压改变而使肠液增加，患者出现水样腹泻。1.3多基因病•如果一种遗传病的发病涉及多个基因，由多个微效的基因累加作用共同影响下造成的疾病称作多基因病。多基因遗传病发病也受环境因素的影响，患者同胞的发病率大约仅1%～10%。•常见的多基因遗传病有消化性溃疡、原发性高血压、先天性心脏病、哮喘、精神分裂症、无脑儿、糖尿病等，以及先天畸形（唇腭裂、脊柱裂、无脑儿等）。1.3.1先天性心脏病心室间隔缺损（VSD）心房间隔缺损（ASD）法洛四联症1.3.2基因缺陷病先天性幽门狭窄先天性髋脱臼先天性巨结肠症1.4治疗方法•传统治疗方法1.药物治疗2.手术治疗3.放射治疗4.理疗•新的生物治疗：基因治疗(genetherapy)基因缺陷病的产前诊断内容基因治疗基因治疗的应用基因缺陷病2基因治疗•基因治疗（genetherapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。•狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗，而广义的基因治疗还包括利用基因药物或核酸药物的治疗。2.1基因治疗的策略•直接策略针对致病基因•间接策略导入与致病基因无直接联系的治疗基因2.1.1直接策略针对致病基因•基因修正（genecorrection）•基因替代（genereplacement）•基因增强（geneaugmentation）•基因干预（geneinterference）2.1.1.1基因修正•基因修正（genecorrection）指将致病基因的突变碱基加以纠正，而保留正常部分。2.1.1.2基因替代•基因替代（genereplacement）指通过同源重组（基因打靶）技术，将正常基因定点整合到靶细胞基因组内，以原位替换致病基因。（不涉及基因组整体改变的情况下对缺陷基因进行精确的原位修复，是最理想的治疗方式。）基因打靶2.1.1.3基因增强•基因增强（geneaugmentation）又称基因修饰，是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生非定点整合，表达正常产物以补偿缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加强。目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检形成。基因增强奥运2.1.1.4基因干预•基因干预（geneinterference）是采用特定的方法，导入外源基因选择性地阻断、干扰、抑制和封闭有害基因在DNA、RNA和蛋白质水平的表达及其生物合成。1.导入抑癌基因2.反义核酸技术(antisensetechnology)：①反义RNA；②反基因技术；③核酶3.RNA干扰（RNAinterference)2.1.1.4.1抑癌基因疗法•抑癌基因：是正常细胞内正常存在的，能抑制细胞转化和肿瘤生的一类基因群。Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因2.1.1.4.2反义核酸技术•反义RNA（antisenseRNA）与mRNA互补的RNA，抑制mRNA的加工与翻译。•核酶（ribozyme）具有催化功能的RNA，其与相应mRNA结合后能发挥酶活性，将mRNA降解。•反义脱氧寡核苷酸，ODN核酶2.1.1.4.3RNA干扰•概念：短的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使同源mRNA发生特异性的降解，从而阻断相应基因的表达。•特点1.高度的序列专一性2.高效性3.易操作性2.1.2间接策略导入与致病基因无直接联系的治疗基因•免疫基因治疗•分子化疗•特异性细胞杀伤2.1.2.1免疫基因治疗•将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。1.细胞因子基因治疗IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF2.免疫增强基因疗法MHCI类抗原、共刺激分子3.肿瘤DNA疫苗疗法癌胚抗原（CEA）制备的肿瘤DNA疫苗2.1.2.2分子化疗•自杀基因疗法：TK基因、CD基因•化疗保护性基因治疗：MDR基因•药物增敏基因治疗：钙调素基因自杀基因+病毒载体转染重组载体药物前体无毒Gene→酶→↓药物复合物有毒细胞死亡2.1.2.2.1自杀基因疗法•自杀基因（suicidegene)，前体药物酶转化基因。自杀基因药物前体无毒Gene→酶→↓药物复合物有毒细胞死亡2.1.2.2.2化疗保护性基因治疗•指将编码抗细胞毒性药物蛋白的基因导入人体细胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力。•如将多药抗性（multipledrugresistance,MDR）基因MDR-1导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受抑制的程度，以加大化疗剂量，提高化疗效果。2.1.2.2.3药物增敏基因治疗•将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对药物的敏感性。•如将钙调素基因转入癌细胞，其表达产物作为细胞内信号转导系统的重要物质，明显增强肿瘤细胞对化疗药物的吸收量而相应减少了排出量，使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。2.1.2.3特异性细胞杀伤•指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特异性杀伤该肿瘤细胞。PEDT2.2基因治疗的种类•基因导入的方式1.exvivo途径2.invivo途径•按靶细胞1.生殖细胞基因治疗2.体细胞基因治疗2.2.1基因导入方式•直接体内疗法（invivo）是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。•间接体内疗法（exvivo）是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。2.2.1.1直接体内疗法•是一种简单易行的方法，如肌肉注射、静脉注射、器官内灌输、皮下包埋等，但其缺点是转染率较低。2.2.1.2间接体内疗法•间接体内疗法最常用的技术有3种1.体外处理疗法：将有基因缺陷的体细胞取出后，引入正常的基因拷贝后再送回体内；2.原位疗法：使用载体将目的基因直接导入靶细胞；3.体内疗法：将基因载体注入血液，定向寻找靶细胞并将基因安全有效地导入。2.2.2靶细胞类型•生殖细胞基因治疗(germcellgenetherapy)以生殖细胞为对象的基因治疗称为生殖细胞基因治疗，广义的生殖细胞基因治疗以精子、卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。•体细胞基因治疗(somaticcellgenetherapy)治疗将遗传物质引入人的体细胞进行基因治疗的方法称为体细胞基因治疗。3.2基因治疗的基本程序1.外源基因的选择与制备2.载体的选择与构建3.靶细胞的选择4.基因转移5.基因转染细胞的筛选与鉴定6.回输体内3.2.1外源基因的选择与制备•外源基因目的基因：与致病基因相对应的有功能的正常基因与致病基因无关、有治疗作用的基因标记基因:新霉素磷酸转移酶（Neo）基因•外源基因的获得基因克隆人工合成PCR扩增外源基因选择规则3.2.2载体的选择与构建•病毒载体：1.逆转录病毒（RV)2.腺病毒（AV)3.腺相关病毒（AAV)4.单纯疱疹病毒（HSV)5.痘苗病毒（VV)•非病毒载体：1.脂质体法2.直接注射法3.受体介导基因转移4.DNA-磷酸钙共沉淀5.电穿孔•目前用于基因治疗的载体可分为病毒载体（利用治病基因取代天然病毒某些基因）和非病毒载体（基于DNA的人工复合物或微粒）两种。3.2.2.1逆转录病毒•结构基因1.gag(groupantigen)：编码核心蛋白和属特异性抗原2.pol(polymerase)：编码逆转录酶3.env(envelop)：编码病毒外壳蛋白和包膜蛋白•LTR调控序列含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号5’LTRgagpolenv3’LTR构建、包装特点、问题3.2.2.2腺病毒载体•基因组：双链无包膜DNA病毒，36kb•通过受体介导内吞作用进入细胞，基因导入效率高。•不整合宿主基因组，安全。•宿主细胞范围广泛。•可口服、喷雾吸入或气管内滴注。•载体容量大。•体外容易培养制备，病毒滴度较高。3.2.2.3常用的病毒载体及其基因转移的特点逆转录病毒腺病毒腺相关病毒单纯疱疹病毒基因组正链RNA线性dsDNA线性ssDNAdsDNA8～11kb36kb4.7kb152kb外源基因容量8kb2～7kb3.5kb30kb重组病毒滴度中高较低高靶细胞状态分裂细胞，表面分裂细胞或分裂细胞或分裂细胞或须有特殊受体非分裂细胞非分裂细胞非分裂细胞基因转移效率高高高高基因整合随机整合不整合定点整合于不整合染色体19q外源基因表达状况短暂/稳定表达短暂表达稳定表达短暂/稳定表达安全性及其它相对较安全可引起炎症无病原性可能出现毒性反应宿主范围广和免疫反应神经细胞嗜向性3.2.2.4脂质体•脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。其基本原理是利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起温育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA转