基因组和染色体

第二章有机体、染色体和基因第一节原核生物和真核生物一、生命有机体的划分1、两界系统理论：原核生物和真核生物。2、三界系统理论：真细菌、古细菌和真核生物。3、五界系统理论：原核生物界、原生生物界、真菌界、植物界、动物界。二、原核生物和真核生物的概念1、原核生物：由无核膜的细胞组成的生命体称为原核生物。2、真核生物：由有核膜的细胞组成的生命体称为真核生物。3、病毒：既不是真核生物，也非原核生物，属于亚细胞形态的生命体。三、原核生物和真核生物的差异特征原核细胞真核细胞遗传组织核膜染色体数目核小体结构核仁遗传交换无1无无质粒介导，单向有1有有配子融合细胞结构内质网高尔基体溶酶体线粒体叶绿体核糖体大小微管肽聚糖细胞壁无无无无无70s无有（支原体、古细菌除外）有有有有植物中有80s有无细胞的某些功能吞噬作用胞饮作用电子传递部位胞质流动无无细胞膜无有时有有时有线粒体膜有第二节基因组大小和C值矛盾一、基因组和C值的概念基因组(genome)：一个物种的单倍体的染色体的数目，如人类2n=46;C值：一个单倍体基因组的DNA含量总是恒定的,称为该物种的DNA的C值。如人类DNA的C值约为3*109bp。显花植物鸟类哺乳类爬行类两栖类骨鱼类软骨鱼类棘皮类甲壳类昆虫类软体动物蠕虫类酶菌藻类真菌革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌枝原体10610710810910101011图10-37不同门类生物的C值分布(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig21.1)现象：不同物种的C值差异很大；生物体的结构和功能越复杂，其C值就越大；C值的矛盾现象：在结构和功能很相似的同一类生物中，甚至在亲缘关系十分接近的物种之间，其C值可以相差数十倍乃至数百倍。如两栖动物之间，两栖动物和哺乳动物之间；同一种生物的C值的数量远远超出编码基因的核苷酸的序列。如人的C值目前所知只有20%编码。C值矛盾：生物的C值与其结构或组成的复杂性不一致的现象。二、人类基因组计划1990年开始（美、英、德、法、日、中），15年，耗资30亿，破解30亿个核苷酸组成的DNA序列，被称为生物学上的登月计划。2003年全部完成。曼哈顿原子弹计划阿波罗登月计划第三节原核生物染色体及其基因一般只有一个染色体即一个核酸分子；多为双螺旋结构，少数为单链；核酸分子多为环状，少数为线状。E.Coli、ф×174噬菌体和λ噬菌体。一、E.coli的染色体1、类核（nucleoid）无明显核结构，细菌中的DNA集中在胞内相对集中的区域形成类核。类核中DNA占80%，其余为RNA和蛋白质（稳定类核的作用）。类核结构2、DNA结合蛋白H：2个28KDa的相同亚基，每个细胞3万个二聚体，相当于真核生物H2A，基因位点未知；HU：2个9KDa的不相同亚基，每个细胞4万个二聚体，相当于真核生物H2B，基因位点未知；HLP1：17KDa的单位，2万个单位，基因位点firA；P：3KDa的亚基，相当于真核生物的精蛋白，基因位点未知；3、染色体DNA的手脚架结构中心为多种DNA结合蛋白质，而DNA双螺旋分子有许多位点与之结合形成约100个小区，每个小区的DNA都是负超螺旋。一个小区的DNA有两个端点被蛋白质所固定，因而保持每个小区的相对独立性。4、E.coli基因结构的特点大肠杆菌的染色体是一个双链环状DNA分子，由4.2×106个碱基对组成。约有3000-4000个基因，已经定位的基因900多个。大肠杆菌的基因组织结构即经济又有效。（1）基因的表达受操纵元调控功能上相关的几个结构基因（蛋白质基因、rRNA基因）前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点即启动子和操作子在基因转录时协同动作。操纵元（Operon）：是原核生物基因表达和调控的一个完整单元，其中包括结构基因、调节基因、操作子和启动子。PlaciPOlacZlacYlacADNA1040823510780825mRNA多肽3603810211252603027530氨基酸分子量(KDa)蛋白四聚体152四聚体500膜蛋白30二聚体60结构分子量(KDa)功能阻遏蛋白β-半乳糖苷酶透性酶转乙酰酶乳糖操纵子的结构和功能(仿B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997,Fig.12.3)调控元（regulon）：一个调节基因的产物同时作用于两个或两个以上的操纵元，它们共同构成了调控元。启动子（promoter）：DNA分子上结合RNA聚合酶并形成转录起始复合物的区域，在许多情况下还包括促进这一过程的调节蛋白质的结合位点。操作子（operator）：DNA分子上阻遏蛋白的结合位点，用以阻止相邻启动子上转录的起始。未诱导：结构基因被阻遏阻遏物四聚体LacIPOlacZlacYlacA图16-当无诱导物时阻遏物结合在操纵基因上诱导：基因被打开β-半乳糖苷酶透性酶乙酰转移酶图16-7诱导物和阻遏物成为调节操纵子的开关（2）蛋白质基因常以单拷贝的形式存在（3）RNA基因通常是多拷贝的，且多靠近复制原点。如16SrRNA、23SrRNA、5SrRNA各有7个拷贝，它们在染色体上的分布也增加了潜在的基因剂量，以便在短期内装配大量的核糖体。（4）除了把相关基因组织成操纵元的形式之外,各种基因的启动子和操纵子部分的DNA序列也是多种多样的，以便与RNA聚合酶以及与调节基因的产物阻遏蛋白发生不同程度的结合，以对各种基因的表达加以精细的调节。二、φ×174噬菌体的染色体φ×174噬菌体的染色体1、结构很小，无尾，20面体颗粒状；DNA为单链环状，共有5386个核苷酸。1977年，英国剑桥大学的FrederickSanger确定其序列，第二次赢得诺贝尔奖（第一次是蛋白质的测序：确定胰岛素的一级结构）。2、基因只有11个基因：A、A*、B、C、D、E、F、G、H、K。3、基因排布：经济原则（1）11个基因，只转录3个mRNA，分别从A、B、D开始。（2）DNA分子绝大部分用来编码蛋白质，不翻译出来的部分只占4%。（3）重叠基因和基因套基因。迄今为止，只在噬菌体和病毒中发现基因重叠现象。三、λ噬菌体的染色体1、结构共有48502个碱基对，分子量3.2×107道尔顿，长16μm，被包被在由蛋白质组成的头部外壳之中；双链DNA有两种形式：带有切刻的环状分子，切刻部分通过粘性末端互补之间的氢键而连接；两个粘性末端相互分离，形成线形分子。2、溶原状态的维持λ噬菌体以环形分子存在于大肠杆菌体内，或整合到其染色体上，成为原噬菌体状态，与寄主染色体一起复制。这种状态能维持许多代，这种现象叫溶原化。溶原化原因：即cI基因的作用。整合在细菌染色体上的λ噬菌体基因中的cI基因能产生一种分子量为52000道尔顿的阻遏蛋白，这种蛋白能和左、右两个操作子相结合，阻遏两个早期mRNA的转录。因而，也就不能合成λ噬菌体复制所必须的蛋白质。这种阻遏蛋白不但能阻止原噬菌体本身DNA的复制，同样也能结合于新侵入的λ噬菌体的操作子，从而阻止它们的复制，使处于溶原状态的大肠杆菌不再被其他λ噬菌体的感染而裂解。溶原化的解除：cro基因。其产物能够关闭阻遏蛋白的继续合成，从而使转录和翻译继续，最后导致溶菌。第四节DNA的变性、复性、杂交和Cot曲线一、变性（denaturation）1、概念双螺旋DNA在加热或变性剂（如尿素、甲酰胺）的作用下，转变为无规则的线团构型的过程叫DNA变性，也叫DNA溶解。2、导致DNA变性的方法（1）热变性方法（2）碱变性方法：pH11.3或盐浓度〈0.01M。3、测量变性的方法分光光度计、流体力学法、层析法等。4、变性DNA物理性质的变化（1）流体力学性质的变化黏度下降，沉降速度增加。（2）增色效应由于DNA的变性而引起的光吸收的增加。发色集团藏在DNA结构内部，DNA变性后暴露出来，从而提高了DNA对紫外线的吸收能力。如：双螺旋DNA(50ug/ml)：A260=1.00；单链DNA:A260=1.37；单核苷酸：A260=1.60。5、熔解曲线和熔点熔解曲线：以缓慢而均匀地增加的DNA溶液的温度为横坐标，各个不同温度下的A260数值为纵坐标，所绘制出曲线即为DNA的熔解曲线。熔点：当DNA的A260增加到最大增值的一半时的温度。二、复性1、概念将DNA变性后分开的互补链缓慢冷却，重新形成互补双链的过程。2、复性条件（1）足够的盐浓度：常见的0.15-0.5MNaCl；（2）足够高的温度：高于熔点20-25度；（3）DNA片段的大小：成反比；（4）DNA的浓度：成正比；（5）DNA的复杂性：成反比。3、复性的机制（1）单链分子无规则的随机碰撞；（2）成核作用能够配对的一部分碱基相互靠近，形成一个或几个双螺旋核心（10-20bp，富含GC）；（3）拉拉链作用其余部分象拉拉链那样迅速形成双螺旋结构。4、复性的检测（1）减色效应，减少30%；（2）羟基磷灰石柱层析：对双链的吸附较牢。三、杂交1、概念由2条来源不同的DNA单链经过复性形成DNA分子的过程。产物称为杂交分子，也叫异源双链DNA。2、作用（1）检验DNA的缺失、插入；（2）根据不同物种DNA分子的同源性确定其进化关系。四、Cot曲线1、公式推导（复性动力学公式）DNA复性是一个双分子二级反应：2ssDNA(K2)-----dsDNA(K)K与阳离子的浓度、温度、片段大小和复杂性有关。那么单链的消失速度为：dC/dt=-KC2(反应的速率与浓度的平方呈正比)dt=-1/kC-2dC积分后：t=1/k(1/C-1/Co)kt=1/C–1/CokCot=Co/C-1Co/C=1+kCotC/Co=1/(1+kCot)2、Cot曲线由函数C/Co=1/(1+kCot)绘制的以C/Co为纵坐标，Cot为横坐标的图。C/Co=1/(1+kCot)3、Cot1/2当C/Co=1/2时的Cot值，Cot1/2=1/kCot1/2不仅与K值相关，而且与DNA的复杂性X（最长的没有重复序列的核苷酸的数值）有关（正比）。如ATATATX=2;ATCGATCGX=4。Cot1/2与基因组的大小呈正比。基因组越大，复性越慢。当以1-C/Co为纵坐标，以Cot为横坐标作图第五节真核生物染色体线形、多条成分:真核生物染色体中，DNA约占27%，组蛋白和非组蛋白占66%，RNA占6%。一、真核生物DNA复性动力学1、原核生物DNA复杂性的计算以E.coliCot1/2为标准计算样品DNA的复杂性：（1）各种原核生物DNA都是单一序列，只是其序列复杂性各不相同。（2）DNA序列复杂性Cot1/2值就呈正比。（3）复杂性（复杂长度）的计算公式：复杂长度＝4.2×106bp×(样品DNACot1/2／大肠杆菌DNACot1/2)2、真核生物DNA的复杂性(1)动力学复杂长度的计算复性反应分为三相:第一相-快复性组分：25%的总DNA，Cot1/2=0.0013；第二相-中间复性组分：30%的总DNA，Cot1/2=1.9；第三相-慢复性组分：45%的总DNA，Cot1/2=630。三种组分的复杂性应该分别计算:慢复性组分的复杂长度=大肠杆菌DNA复杂长度×Cot1/2×45%/大肠杆菌的Cot1/2=4.2×106×630×45%/4=3×108bp同理，中复性组分的复杂长度=4.2×106×1.9×30%/4=6×105bp快复性组分的复杂长度=4.2×106×0.0013×25%/4=340bp(2)化学复杂长度计算（利用化学方法测量DNA的长度）等于单一序列的动力学复杂长度/其在基因组中的百分比。上例中=慢复性组分的复杂长度/45%=6.7×108bp(3)重复频率计算①重复频率=化学复杂长度/动力学复杂长度f慢＝7×108bp×45%/3×108bp=1f中＝7×108bp×30%/6×105bp=350f快＝7×108bp×25%/340bp=500000②根据重复频率与Cot1/2成反比f中＝Cot1/2慢／Cot1/2中×f慢＝630/1.9=332f快＝Cot1/2慢／Cot1/2快×f慢＝630／