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酸谈实验室众妙书院辅修课课堂笔记02基因表达检测:PCR引物设计主讲人猫大酸谈实验室课堂笔记021第2颗基因表达检测:PCR引物设计回顾——rtPCR原理:P.S.引物-模板接头是PCR反应的重要底物引物设计流程:找到目的基因CDS序列的保守区域用软件设计引物用软件评价引物Blast引物特异性引物设计软件:OLIGO序列比对软件:DNAMANRNAcDNAreversetranscription94℃Denaturation3’5’68℃~72℃RNA抽提?反转录引物?PCR程序PCR酶PCR体系PCR产物检测Annealing3’5’5’3’55℃~72℃PrimerExtension3’5’5’3’Taq猫大同款软件1猫大同款软件2酸谈实验室课堂笔记022引物设计操作:1、找模板序列:方法1)NCBINuciotidetranscript(人)CDs保存seq文件方法2)NCBIGene(任意物种)RefseqRNAtranscriptCDs保存seq文件2、找CDs保守区域:DNAMANSequenceAlignmentMultipleSequenceAlignmentFile打开seq文件下一步×3,完成取白底黑字序列保存或贴到OLIGO里3、设计引物:OLIGOChangeCurrentOligoLength修改引物长度Tm框里搜索合适引物,用Upper和Lower选定4、评价引物:AnalyzePCR5、保存引物:EditCtrl+C,Ctrl+V贴到excel表里p.s.软件相关提示这里不要出现字!这里不要出现字!这里不要出现字!酸谈实验室课堂笔记023软件可能出现的一些提示及应对措施:引物间有二聚体,随意挑一条引物挪动几个碱基;有两个可用的温度,随意挑一条引物挪动;下游引物的一端稳定性太高,把下游引物往柱子低一点的地方挪;上下游引物的末端稳定性都太高,那就把两条引物都挪往低一点的地方去吧。引物设计要点:引物长度:18~30碱基。——Change改变引物长度引物GC含量:40%~60%——选两条虚线间的碱基Tm值:Tm值在72℃左右,上下游引物的Tm保持一致。——选择合适的位置,设置合适的引物长度,3’端Tm比5’端低避免扩增模板的二级结构区域——选择合适位置的碱基避免引物的二级结构——选择合适位置的碱基避免与靶DNA的错配——尤其注意3’端P.S.也要注意产物长度,rtPCR的产物长度控制在300-500bp,如果实在找不到合适引物,标准可适当放宽
本文标题:PCR引物设计
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