多肽类抗生素从多粘杆菌或产气孢子杆菌的培养液中提取制得

2011级化教四班柏飞飞20110513401多肽类抗生素从多粘杆菌或产气孢子杆菌的培养液中提取制得。随着生物技术的发展，多肽作为药物在临床上的应用越来越广泛，相应的制剂学研究也日益受到重视。与传统的小分子有机药物相比，多肽具有稳定性差，本文从稳定性、缓释系统、非注射途径给药三方面对多肽类药物制剂的研究概况进行介绍。多肽类抗生素具有多肽结构特征，其包括多粘菌素类（多粘菌素B、多粘菌素E）、杆菌肽类（杆菌肽、短杆菌肽）和万古霉素。1.结构及性质：多粘菌素：多粘菌素（polymyxin）是发现于多粘杆菌（Bacilluspolymyxa）培养液中的抗菌性多肽，有A、B、C、D、E等五种。抗菌谱相互类似而范围宽广，特别对革兰氏阴性细菌作用颇强，毒性较弱。主要应用于绿脓杆菌及其它假单胞菌引起的创面、尿路以及眼、耳、气管等部位感染，也可用于败血症、腹膜炎。不良反应：毒性较大。主要表现在肾脏及神经系统两方面，其中多粘菌素B较E尤为多见，症状为蛋白尿、血尿等。大剂量、快速静脉滴注时，由于神经肌肉的阻滞可导致呼吸抑制。杆菌肽：类白色或淡黄色的粉末；无臭，味苦；有引湿性；易被氧化剂破坏，在溶液中能被多种重金属盐类沉淀。本品在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮、氯仿或乙醚中不溶。对大多数革兰阳性菌和奈瑟球菌有抗菌作用，现作外用抗菌药，局部应用，也可口含，治口咽部感染。对绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌，以及嗜血杆菌、肠杆菌属、沙门菌、志贺菌、百日咳杆菌、巴斯德菌和弧菌等革兰阴性菌有抗菌作用。不良反应：(1)本品局部用于腹腔手术或灌注于感染体腔用药量较大时，可有微量吸收，有引致肾毒性发生的可能。(2)过敏反应，皮肤局部瘙痒、皮疹、红肿或其他刺激现象，一般反应轻微。偶有局部用药后发生严重全身过敏反应者。本品全身应用时，可引起严重肾毒性反应，受损部位以肾小管为最明显，肾小球的滤过功能也受到抑制，尿的异常发现于给药的第3～4日，至5～7日达高峰，以后虽继续用药，情况有时反见改善。随着蛋白尿、管型尿等的出现，肾功能也显示减退，严重者可发生急性肾小管坏死和死亡。由于它的毒性大，且其他具有同样疗效的低毒性抗生素的出现，故目前本品仅供局部使用。局部应用软膏时也有极少数病人产生过敏反应。万古霉素：主要用于葡萄球菌（包括耐青霉素和耐新青霉素株）、难辨梭状芽胞杆菌等所致的系统感染和肠道感染，如心内膜炎、败血症、伪膜性肠炎等。不良反应耳毒性、肾损害严重，与剂量大小有关。大剂量应用、肾功能不全和老年人易发生、应进行血药浓度监测。偶见过敏反应。对血管有刺激性，静脉滴注时可发生恶心、寒战、药热，所以药物浓度不宜过高、速度不易过快，另外听力减退、耳聋、肾功能不全者禁用。多肽化学性质：（1）脱酰胺反应：在脱酰反应中，Asn/Gln残基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脱酰胺反应的进行。在Asn-Gly-结构中的酰胺基团更易水解，位于分子表面的酰胺基团也比分子内部的酰胺基团易水解。（2）氧化：多肽溶液易氧化的主要原因有两种，一是溶液中有过氧化物的污染，二是多肽的自发氧化。在所有的氨基酸残基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分压、温度和缓冲溶液对氧化也都有影响。（3）水解：多肽中的肽键易水解断裂。由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂，尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽键。（4）形成错误的二硫键：二硫键之间或二硫键与巯基之间发生交换可形成错误的二硫键，导致三级结构改变和活性丧失。（5）消旋：除Gly外，所有氨基酸残基的α碳原子都是手性的，易在碱催化下发生消旋反应。其中Asp残基最易发生消旋反应。（6）β-消除：β-消除是指氨基酸残基中β碳原子上基团的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr等残基都可通过β-消除降解。在碱性PH下易发生β-消除，温度和金属离子对其也有影响。（7）变性、吸附、聚集或沉淀：变性一般都与三级结构以及二级结构的破坏有关。在变性状态，多肽往往更易发生化学反应，活性难以恢复。在多肽变性过程中，首先形成中间体。通常中间体的溶解度低，易于聚集，形成聚集体，进而形成肉眼可见的沉淀。蛋白质的表面吸附是其贮存、使用过程中遇到的另一个令人头痛的问题，如riL-2在进行曲灌注时会吸附在管道表面，造成活性损失。2.鉴别：杆菌肽：取本品与杆菌肽标准品，加1％乙二胺四醋酸二钠溶液分别制成每1ml中含6.0mg的溶液，照薄层色谱法（附录ⅤB）试验，分别取上述两种溶液各5μl点于同一硅胶ＧＦ254板（临用前于105℃活化1至2小时）上，自然干燥，以正丁醇－冰醋酸－水－吡啶－乙醇(60:15:10:6:5)为展开剂，展开后，晾干，喷以1％茚三酮的丁醇－吡啶(99:1)溶液，于105℃加热约5分钟，至出现棕红色斑点。供试品与标准品所显斑点的颜色与位置应一致。3.特殊实验：杆菌肽敏感试验：1、样品处理：取25g固体（或25mL液体）检样加入225mL灭菌生理盐水，制成混悬液。2、吸取5mL混悬液接种至50mL葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线于血平板（如检样污染严重，可同时接种5mL至匹克氏肉汤），36℃培养24h，接种血平板，36℃培养24h,挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，观察在液体和固体中的培养特征、溶血情况及革兰氏染色、形态，并进行链激酶试验和杆菌肽敏感试验。3、杆菌肽敏感试验：取典型菌落的菌液涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片置于上述平板上，36℃培养18-24h，如有抑菌圈出现即为阳性。用已知的阳性菌株做对照。4.含量测定：经典化学方法多肽类药物含量测定方法与某些蛋白质含量测定方法类似,目前常用的4种经典含量测定方法有定氮法、双缩脲法、福林-酚试剂法和紫外分光光度法,考马斯亮蓝法则是近10年才普遍使用的新的含量测定方法。这些方法虽灵敏度不高,干扰因素多,但有一定的通用性和经济性,至今仍被用于蛋白质和多肽类药物的含量测定。1.凯氏定氮法凯氏定氮法是目前含氮化合物含量测定最常用的方法，其原理为：在硫酸铜的催化下，将样品用氧化性试剂消化分解而转化为硫酸铵，然后将硫酸铵溶液至于蒸馏瓶中，在碱性条件下将其转换为氮，并随水蒸气流出，用过量标准硼酸溶液吸收后，再以标准硫酸或盐酸溶液滴定，以甲基红为指示剂，根据标准盐酸消耗量计算出多肽含量。该法所用仪器简单，测定结果准确，重现性好，但操作费时，试剂消耗量大，含氮的非肽类药物为主要干扰杂质。2.双缩脲法双缩脲法的原理是利用蛋白质和多肽分子中含有肽键（--CO-NH--），具有双缩脲反应的特性，记在碱性溶液中，蛋白质或多肽可与Cu2+形成在540nm处具有最大吸收的紫色或蓝色络合物，其颜色的深浅与蛋白质或多肽的浓度成正比，从而利用比色法特异性测定蛋白质或多肽的含量。该方法虽精密度好，干扰物少，但线性范围很窄，准确性和灵敏度不高，一般测试质量浓度介于1~10g.L-1之间，故常用于对精密度要求不高的快速含量测定。3.福林—酚试剂法福林—酚试剂法是在双缩脲法的基础上发展起来的多肽含量测定方法，即在双缩脲体系反应中另加入福林—酚试剂（即磷钼酸—磷钨酸试剂），该试剂在碱性条件下，易被多肽中酪氨酸的酚基还原呈蓝色，显色量较双缩脲法增加，从而提高了检测的灵敏度，灵敏度为双缩脲法的100倍，福林—酚试剂法的蛋白质定量范围为25~250μg，测得的结果准确，可靠，易操作。4．紫外分光光度法紫外分光光度法适用于含有芳香族氨基酸的多肽含量定量分析，再280nm处具有最大吸收峰，且在此波长处的吸光度值与蛋白质浓度成正比。对于不含芳香族的氨基酸含量测定灵敏度低。该方法操作简单，迅速，样品可回收。5.考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法灵敏度高，定量限为1μg左右，测定快速简单，只需一种试剂，5min左右即可完成一个样品的测定，干扰物少，该法适用于含碱性氨基酸的肽含量的测定。此外还有色谱分析方法，反相高效液相色谱法等。