大豆蛋白的提取与含量测定

大豆蛋白的提取与含量测定指导老师王国彦序言蛋白质化学实验蛋白质是一切生物体内重要的组成成份，蛋白质是由二十多种氨基酸以肽键相互联接而成的复杂的高分子化合物，溶于水时形成亲水胶体溶液。在酸碱和酶的作用下，蛋白质被水解成胶胨肽最后形成氨基酸。蛋白质分子依靠氢键、盐键等副价键维持一定的空间构型。在各种物理化学因素影响下，由于副价键的破裂，使其空间结构遭受不同程度的破坏，蛋白质的物理化学性质和生物学活性也随着改变。该现象称为蛋白质的变性。蛋白质分子是含有酸性基团和碱性基团的两性电解质，在等电点时，蛋白质分子的酸性基团和碱性基团的解离度相等，成为带有正负电荷相等的两性离子，在电场中不向两极移动，并且极易沉淀。氨基酸组成不同的蛋白质，具有不同的等电点。根据在一定条件下（如PH，离子强度等）它们所带电荷的数量和种类，分子的大小及形状等方面的差异，可以采用电泳，离子交换柱层析等方法对它们进行分离分析。许多物理化学因素可以改变蛋白质在水中的溶解度，产生可逆或不可逆沉淀，这些因素（如增加溶液的离子强度，降低溶液的介电常数，调节溶液的PH等）以及一些沉淀剂和胶附剂也常用来分离，提纯蛋白质或除去蛋白质。为了更好地使同学们运用和掌握好理论和实践相结合，把学到的理论应用到实验中，本系列实验安排是从一种生物中提取蛋白质，通过各种物理化学性质使其得到纯化，得到蛋白质，并进行浓度测定，计算其收率。蛋白质性质与应用技术关系图蛋白质酸碱酶极性电荷离子交换层析电泳形状分子量离心凝胶层析肽氨基酸疏水性亲水性低层析一、大豆蛋白的提取目的要求1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法2、计算粗提产率2、学习计算蛋白质收率实验原理大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。试剂和器材1、试剂（1）10%Nacl（2）0.2%NaoH（3）75%乙醇（4）6mol/LHCL（5）1mol/LHCL（6）1mol/LNaoH2、器材（1）离心机（2）烧杯（3）滴管（4）PH试纸等操作方法1、水抽提将豆粉5g用约40毫升左右的蒸馏水少量多次的添加搅拌，常温下搅拌抽提15min，3800r/min离心15min，取上清液，如上清液不清澈再经过滤。取上清液1毫升稀释50倍留做蛋白测定。其余清液加入等体积在冰箱中预冷的丙酮，用滴管少量多次慢慢滴加（搅拌）6mol/L和1mol/LHCL，调PH4.5~5.0，3800r/min，离心15min，收集沉淀物，反复用丙酮搅拌洗涤离心2次，得到粉末状蛋白质干粉，称重，计算粗产率。蛋白质产物重量蛋白质产率=×100%原料总重量思考题1、用丙酮沉淀蛋白时，为何要调PH4.5~5.0？2、大豆中哪类蛋白含量最多？Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分Folin酚法测定蛋白质含量目的要求掌握Folin酚法测定蛋白浓度的原理和方法蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如比重、紫外吸收，折射率等测定而得知；或用化学方法，如定氮、双缩脲反应，Folin酚试剂反应等方法来计算。也可以用染色法，如氨基黑，考马斯亮蓝法测定。还可以用荧光激发法，氰胺，放射性同位素计数等灵敏度较高的方法。在这些方法中，其中双缩脲法和Folin酚法是一般实验室中常用的方法，它们操作简便，迅速，不需要复杂而昂贵的仪器。Folin酚法灵敏度高，比双缩脲法灵敏100倍。原理Folin酚法是所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，蛋白质中的肽键在碱性条件下可与铜离子起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸还原呈兰色，溶液兰色的深浅与蛋白浓度有较好的线性关系。因此用Folin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。样品中含酚类化合物及柠檬酸均有干扰作用，如果样品酸度较高则显色较浅，要提高碳酸钠一氢氧化钠的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度。Folin酚法有不少具有操作方法，但基本原理都是一个，只是在各溶液的浓度及填加量上，保温的温度及保温时间上有所不同而已，本实验所介绍的是本室常用的，灵敏度较高的操作方法。试剂和器材1、材料：本实验所提取大豆蛋白水提取液，经合适稀释至可测定范围。2、试剂：（1）0.03mol/LPH7.8的磷酸缓冲液。（2）200μg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。（3）Folin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：10gNaoH溶于400ml水中，再加50gNa2CO3；称取0.5g酒石酸钾钠溶于80mlH2O中，再加0.25gCuSO4；以上两溶液混合定容到500ml，冰箱保存可用一个月。4、Folin试剂乙：在2升磨口回流装置的烧瓶内，加钨酸钠（NaWO4·2H2O）100g，钼酸钠（NaMoO·2M2O）25g，蒸馏水700ml，85%的磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后，小火回流10小时，再加硫酸锂（Li2SO4）150g，蒸馏水50ml及数滴溴。然后开口沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml，过滤后呈金黄色，于棕色并中保存，可使用多年。上述制备的Folin试剂乙的贮备液浓度一般在2mol/L左右，几种操作方案都是把Folin试剂乙稀释至1mol/L的酸度作为应用液，我们是把贮备液于作用前稀释18倍，使之浓度为0.1mol/L略高。这种稀释18倍后的Folin试剂乙就是下文称之为应用液，Folin试剂乙贮备液浓度的标定，一般是以酚酞为指示剂，用Folin试剂乙去滴定1mol/L左右的标准NaOH溶液，当溶液颜色由红变为紫灰色，再突然变成黑绿既为终点。如果用NaOH去滴定Folin乙，终点不太好掌握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。3、器材：试管10支试管架一个移液管：（5ml、1ml）移液管架洗瓶恒温水浴723型分光光度计操作方法1、标准曲线的制作：标准酪蛋白溶液：用0.03mol/L的磷酸缓冲液溶解的酪蛋白，浓度为200μg/ml。用一支0.5ml移液管分别取上述标准酪蛋溶液0ml,0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml各加到一支试管中去，将此吸管用0.03mol/LPH7.8的磷酸缓冲液，反复洗净，再用同一支移液管（防止未经标定吸量管的相对误差的影响）取上述缓冲液将每支试管中的溶液补加至1ml。再在另一支试管中加入1ml缓冲液作空白对照。于上述试管中各加入1mlFolin试剂甲并不时地进行振荡，10min后再加入后1in试剂乙的应用液4毫升。立既摇匀放入55℃水溶中保湿5min。取出后用自来水冷却1min。于波长650nm进行比色测定各管的OD值，以蛋白质的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，既可得到标准曲线。Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：取7支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定试管号1234567蛋白质标准液（ml）（mg)000.10.020.20.040.40.080.60.120.80.161.00.2PH7.8的buffer（ml）10.90.80.60.40.20Folin-甲试剂（ml）1111111于室温下不停地振荡10minFolin-乙应用液（ml）4444444立即摇匀，在55℃恒温水浴中保温5min，用流水冷却1min后，测A650A650值2、样品测定：取两支试管（平行）各加入待测的蛋白质样品液1ml（不加buffer），其他操作同工作曲线（可取两支试管编号8、9，与工作曲线同时进行反应和比色测定）；试管号89蛋白质稀释液（ml）（mg)11PH7.8的buffer（ml）00Folin-甲试剂（ml）11于室温下不停地振荡10minFolin-乙应用液（ml）44立即摇匀，在55℃恒温水浴中保温5min，用流水冷却1min后，测A650A650值3.蛋白质浓度的计算：A650值对应的mg数(Pr)Pr(mg/ml)=×稀释倍数Pr溶液的ml数思考题1、采用Folin的酚法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？2、作为标准蛋白的酪蛋白在应用时有何要求。