头孢他啶无菌检测方法的研究

成人高等教育毕业设计（论文）题目：头孢他啶无菌检测的验证专业：药学学习层次：专科形式：函授年级：2009级学号：3090109015姓名：贺海霞指导教师：王珊珊（2011年12月）广东食品药品职业学院成人教育学院-2-毕业论文成绩考核表指导教师评语：指导教师（签章）（公章）200年月日评审小组意见：负责教师（签章）成绩：200年月日注：毕业论文要求具有中级以上职称的教师或专业技术人员为指导教师，指导教师应对学生实习过程中的实验技能、论文完成情况和综合能力作出全面评语。成绩评定由学校评审小组按论文实际水平评定。成绩按优秀、良好、中等、及格、不及格五级记分。-3-摘要目的：证明所采用的无菌检查方法适合于头孢他啶无菌原料药的无菌检查。方法：参照2010年药典进行实验，对所采用的方法进行方法学验证。以6种菌种为验证菌种，冲水量为单因素，以菌种的生长情况为评定指标，研究其最适冲水量，使其更符合药典要求。结果：实验证明缓冲液的冲洗量达到500mL时，除金黄色葡萄球菌外，供试品阳性对照菌株与阳性对照相比，生长良好，浑浊度相似，而金黄色葡萄球菌的冲洗量则需达到600mL才有此效果，另阴性对照均无菌生长。结论：头孢他啶的此种无菌检查方法对各菌种没有抑制作用或抑制作用被解除，该方法适合用于头孢他啶的无菌检测。关键词：头孢他啶无菌检测验证冲洗量前言头孢他啶为半合成的第三代头孢菌素类抗生素，抗菌活力较强，抗菌谱较广，对革兰阳性菌、阴性菌产生的β-内酰胺酶具有高度的稳定性。临床多用于敏感革兰氏阴性杆菌所至的败血症、下呼吸系感染、腹腔胆系感染、复杂性尿路感染和严重皮肤软组织感染等。头孢他啶最大特点是对细菌所产生破坏药物作用的水解酶有高度稳定性，在体内几乎不发生代谢生物转换，主要以呈高度活性的原形药物随尿液排泄。随着2010药典的出版，对头孢他啶的无菌检测也提出了新的要求，本论文主要针对药典的相关改动，进行头孢他啶新方法检测的验证，使头孢他啶的无菌检测更符合药典的要求，并为以后的实验提供一些依据。实验部分1仪器与材料：1.1仪器：SP-530生化培养箱、JYT-1架盘药物天平、层流工作台（置于100级超净工作台背景下）、YG-0.36脉动真空灭菌柜、全封闭集菌仪、一次性三联式集菌培养器1.2材料：头孢他啶无菌原料药：由本制药厂提供；硫乙醇酸盐流体培养基：用于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌、生孢梭菌的无菌检测培养；改良马丁培养基：用于白色念珠菌、黑曲霉的无菌检测培养；营养肉汤培养基：用于制备各种新鲜菌液；pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液：冲洗液；0.9%氯化钠溶液：用于供试品的溶解。-4-菌种（第二代）：所采用菌种均为新鲜培养，且菌落数已知，均在50~100cfu/mL范围内，可以使用,其中金黄色葡萄球菌57cfu/mL,大肠埃希菌51cfu/mL,枯草芽孢杆菌62cfu/mL,白色念珠菌56cfu/mL,黑曲霉59cfu/mL,生孢梭菌67cfu/mL。2方法：2.1准确称取供试品27.0g，加适量无菌碳酸钠使其溶解后，转移至500mL0.9%无菌氯化钠溶液中，用全封闭集菌仪过滤，编号为A1、A2、A3、再用pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液依次冲洗集菌仪四次，每次100mL，在最后一次冲洗时，分别往A1、A2集菌培养器中分别加入1mL金黄色葡萄球菌，1mL大肠埃希菌，A3则不加任何东西，冲洗完后往每个培养器中注入100mL硫乙醇酸盐流体培养基，在32℃下培养14天，每天观察并记录结果。2.2准确称取供试品27.0g，按2.1进行操作，将1mL生孢梭菌和1mL枯草杆菌代替金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，编号为A4、A5，第三份为A6，冲洗完后往每个培养器中注入100mL硫乙醇酸盐流体培养基，在32℃下培养14天，每天观察并记录结果。2.3准确称取供试品27.0g，按2.1进行操作，将1mL白色念珠菌和1mL黑曲霉代替金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，编号为A7、A8，第三份为A9，冲洗完后往每个培养器中注入100mL改良马丁培养基，在25℃下培养14天，每天观察并记录结果。2.4阳性对照取六个培养器，用200mL缓冲液冲洗，最后一次冲洗前加入1mL各种菌液，冲洗后注入100mL相应培养基，在相应温度下培养14天，每天观察并记录结果。2.5阴性对照取两个培养器，用200mL缓冲液冲洗后分别注入100mL硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基，在相应温度下培养14天，每天观察并记录结果。2.6准确称取供试品27.0g，编号为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9，操作方法如2.1至2.5上所述，冲洗量分别改为冲洗500mL。2.7准确称取供试品27.0g，编号为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9，操作方法如2.1至2.5上所述，冲洗量分别改为冲洗600mL。3结果与结论-表示培养液没有变化为阴性，+表示培养液变浑浊为阳性。-5-3.1金黄色葡萄球菌培养温度：32℃冲洗量（mL）培养时间（天）1234567891011121314A1400---///////////B1500--+///////////C1600+/////////////A3400--------------B3500--------------C3600--------------阳性对照200+/////////////阴性对照200--------------结论缓冲液的冲洗量达到600mL时，金黄色葡萄球菌与阳性对照相比，细菌生长良好，培养液浑浊程度相似，且供试品和阴性对照均无菌生长，证明供试品的检验量在该检验条件下对金黄色葡萄球菌无抑制作用或抑制作用被解除。2大肠埃希菌培养温度：32℃冲洗量mL培养时间（天）1234567891011121314A2400--+///////////B2500+/////////////C2600+/////////////A3400--------------B3500--------------C3600--------------阳性对照200+/////////////阴性对照200--------------结论缓冲液的冲洗量达到500mL时，大肠埃希菌与阳性对照相比，细菌生长良好，培养液浑浊程度相似，且供试品和阴性对照均无菌生长，证明供试品的检验量在该检验条件下对大肠埃希菌无抑制作用或抑制作用被解除-6-3生孢梭菌培养温度：32℃冲洗量mL培养时间（天）1234567891011121314A4400--+///////////B4500+/////////////C4600+/////////////A6400--------------B6500--------------C6600--------------阳性对照200+/////////////阴性对照200--------------结论缓冲液的冲洗量达到500mL时，生孢梭菌与阳性对照相比，细菌生长良好，培养液浑浊程度相似，且供试品和阴性对照均无菌生长，证明供试品的检验量在该检验条件下对生孢梭菌无抑制作用或抑制作用被解除。4枯草杆菌培养温度：32℃冲洗量mL培养时间（天）1234567891011121314A5400--+///////////B5500+/////////////C5600+/////////////A6400--------------B6500--------------C6600--------------阳性对照200+/////////////阴性对照200--------------结论缓冲液的冲洗量达到500mL时，枯草杆菌与阳性对照相比，细菌生长良好，培养液浑浊程度相似，且供试品和阴性对照均无菌生长，证明供试品的检验量在该检验条件下对枯草杆菌无抑制作用或抑制作用被解除。-7-5白色念珠菌培养温度：25℃冲洗量mL培养时间（天）1234567891011121314A7400--+///////////B7500+/////////////C7600+/////////////A9400--------------B9500--------------C9600--------------阳性对照200+/////////////阴性对照200---///////////结论缓冲液的冲洗量达到500mL时，白色念珠菌与阳性对照相比，细菌生长良好，培养液浑浊程度相似，且供试品和阴性对照均无菌生长，证明供试品的检验量在该检验条件下对白色念珠菌无抑制作用或抑制作用被解除。6黑曲霉培养温度：25℃冲洗量mL培养时间（天）1234567891011121314A8400--+///////////B8500+/////////////C8600+/////////////A9400--------------B9500--------------C9600--------------阳性对照200+/////////////阴性对照200---///////////结论缓冲液的冲洗量达到500mL时，黑曲霉与阳性对照相比，细菌生长良好，培养液浑浊程度相似，且供试品和阴性对照均无菌生长，证明供试品的检验量在该检验条件下对黑曲霉无抑制作用或抑制作用被解除。-8-讨论：本次实验所使用的方法是以2010年药典为依据，通过改变冲洗量来检测最适合该药品检测的冲洗量，从而得出较为科学的实验结果，达到准确检测药品是否有污染菌的目的。头孢他啶是对β-内酰胺酶高度稳定的药品，含有此类酶的细菌其化学结构不易被破坏，能有效杀死细菌，是目前常用的抗生素药品之一。实验过程中曾经讨论过如何选取适合冲洗量，最后经过参考要点选定为400mL、500mL、600mL，最后结果表明选择此范围是正确的。结论：以上检验分析表明供试品冲洗量达到600mL后,对所验证的菌种无抑制作用，因此冲洗量达到600mL时，所采用的无菌检查方法适合于该药品的无菌检查。参考文献：中华人民共和国卫生部药典委员会2010年版药典二部附录X111，无菌检查