图位克隆原理.

在拟南芥的众多生态型中最常用的三种是•Landsbergerecta(Ler)•Columbia(Col)•Wassilewskija(Ws)•其中Col生态型用于拟南芥的全基因组测序。MarkerSSLPsCAPsdCAPsInDelSNP•SSLP=simplesequencelengthpolymorphisms简单序列长度多态性又称SSR=simplesequencerepeats比较产物长度•CAPs=cleavedamplifiedpolymorphicsequences酶切扩增多态性利用酶切位点Marker:MIG5-BCLHC•dCAPs=derivedCAPS设计引物引入错配碱基，从而引入酶切位点其它标记InDel=insertion-deletion插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。根据基因组中插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物，这就是InDel标记。部分SSLP就是由InDel转化而来•密度：每6.6kb存在一个SNP=singlenucleotidepolymorphism•单核苷酸多态性•主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。(后面两种情况的多态性一般归为InDel）•密度：每3.3kb存在一个SSLPsF1父本染色体母本染色体F1假设：Aa突变位点BbMarker突变为隐性突变F1配子长根长根长根长根长根短根短根长根长根短根F2短根个体Col单带Ler单带ColLer双带•因为F2代根据表型来筛选个体时，我们人工选择的是短根表型，选择的个体为短根aa，即突变位点不可能存在交换，交换率=0•其他位点可能存在交换，利用带型差异判断交换次数wildtypemutant杂交ColLerF1plant图中的两个亲本不但在A/a位点有差异，在其他位点也存在大量的遗传差异，可以利用这些差异设计分子标记，对染色体的具体区段进行标定。在该例子中，该染色体上总共确定了5个分子标记，标定了5个不同区段。假设：Aa突变位点有5个Marker只有左侧三种植株会选入定位群体自交F2plants假设：只存在单交换分子标记M5与突变位点的遗传距离：10/1006/1004/100(20/(100×2))×100%=10cMM5处发生交换的植株包括三种情况假设：统计100个个体分子标记M4与突变位点的遗传距离：6/1004/100(10/(100×2))×100%=5cM分子标记M3与突变位点的遗传距离：4/100(4/(100×2))×100%=2cMM4m4如何分辨来自于两个亲本的染色体？目前最常用的分子标记是利用两个亲本中同一染色体区段的长度差异来设计的，如左图亲本Ler的M4处染色体区段长于亲本Col中m4染色体区段，在该差异位点两侧设计引物经PCR扩增后得到的PCR产物就会有不同长度，电泳后M4泳动速度慢，m4泳动速度快，因此通过电泳就可以分辨来自于两个亲本的染色体区段包含来自于两个亲本的染色体片段包含来自于Col两条染色体区段包含来自于Ler两条染色体区段注意后两种情况反映的是来自于两个配子的染色体区段的情况Col*********1、4、8、10、11、13、15、18、19共9个样品，只包含来自于亲本Col的染色体区段，没有发生交换Ler***5、6、14共3个样品，只包含来自于亲本Ler的染色体区段，也就是发生了两次交换Col*******2、3、7、9、12、16、17共7个样品，包含1个来自于亲本Col的染色体区段以及1条来自于亲本Ler的染色体区段，即发生了一次交换Ler•突变位点与分子标记M的遗传距离：交换次数配子总数×100%3×2+719×2×100%≈34cM=SSLPsSSLPs•40.48%•20.00%•4.76%4.76%12.5%12.5%36%步骤总结筛选F2代短根移栽提基因组各对引物PCR统计计算Rf缩小范围寻找新Marker扩大群体(筛选重组子)3周左右•在突变位点附近区域内绝大部分的样品跑样结果都应该为只有非重组的Col条带，即记录Rf为0，只有少数的样品存在交换，Rf记为1。•图中的6、12号样品即为重组子什么是重组子•在筛选出6、12号两个重组子以后，假设在目标区域内寻找到新的标记引物，就不需要把所有的个体跑样，只需要跑重组子个体•例：筛选重组子的目的RfMarker1Marker2Marker36号个体10112号个体100表格的跑样结果显示Marker2最接近突变位点，Marker3次之，下一步可以在Marker2和Marker3附近寻找新标记引物1.建议使用一对位于相对确信的区域内的次低重组率标记引用来筛选2.可以根据情况调整用来筛选重组子的Marker3.要选择好用、绝大部分一次就能扩出来的标记引物重组子筛选•1.山大丁老师提供的引物•2.TAIR网上提供的常用Marker•3.AMP上提供的常用Marker•4.TAIR网上公布的所有多态性位点资料引物寻找STEP1:把目标区域内的Marker序列贴进TAIR网上的Seqviewer上搜索目标区域MPK6FP:AATCTTGTAATCTGGTGCGTG•点击目标区域•STEP2:把目标区域内的BAC名字记录下来•例如：K14A17至MRC8之间的BAC名字有•K14A17→MCE21→MGD8→MTO12→MKP6→MIG5→MEB5→MBG14→MRC8•STEP3:把目标区域内的BAC名字分次键入到AMP的Marker搜索栏•注意:•每个株系到精确定位后期可能用到数十上百的MARKER，请将自己使用、订制过的MARKER的相关资料清晰记录下来，便于日后查看。目标区域内基因搜索附加•由于我们以短根为筛选突变体的指标，因此下面提到的突变的基因都应该会导致幼苗短根。隐性突变突变基因：a（短根）正常基因：A（长根）显性突变突变基因：A（短根）正常基因：a（长根）单基因突变•由于我们以短根为筛选突变体的指标，因此下面提到的突变的基因都应该会导致幼苗短根。隐性突变显性突变单基因突变杂交F1代突变体xLeraa（短根）AA（长根）Aa（长根）突变体xLerAA（短根）aa（长根）Aa（短根）杂交F1代隐性突变显性突变单基因突变杂交F2代Aa（长根）3：1AAAa（长根）：aa（短根）Aa（短根）3：1AAAa（短根）：aa（长根）杂交F2代隐性突变显性突变单基因突变杂交F1代突变体xLeraa（短根）AA（长根）Aa（长根）突变体xLerAA（短根）aa（长根）Aa（短根）•注意事项：一般出现的突变大多数为隐性突变，因此理论上F1代都为长根(Aa);如果不是，造成短根表型可能是2种情况：•（1）突变为隐性突变，杂交不成功，种子为母本突变体自交所得（aa），表现为F1代长短分离；•（2）突变为显性突变，杂交F1代为Aa（短根），杂交不成功的母本自交种为AA（短根），表现为F1代全部为短根•注意事项2：由于根长还会受环境因素影响，有时并不能准确判断，例如出现中根、或者对照也长得不好的情况。•建议处理方法：分类后全部移栽，分成长根、中根、短根等，在盆上标明，待苗长大后（2至3周后）编号后单株提取基因组，用任意一对粗定位用的SSLP引物做PCR，验证杂交苗真假。•真的F1杂交苗为双带，假的为单带（col带）隐性突变显性突变单基因突变杂交F2代Aa（长根）3：1AAAa（长根）：aa（短根）Aa（短根）3：1AAAa（短根）：aa（长根）杂交F2代•注意事项：一般出现的突变大多数为隐性突变，因此理论上F2代都为短根(aa)应为播种数的1/4。但实验上，分离是随机的，实际情况未必是3：1，但总体上也应该是长根占大多数，短根占少数。•某些株系，萌发率特别低，因此aa的种子未必能全部萌发，就会使成苗的短根个体低于1/4。因此，统计F2表型时，要统计播种总数、萌发数、长根、短根等项目，以便分析。•注意事项2：•某些株系如果刚好是双突变，则分离比会根据不同情况而偏离3：1，例如15：1等情况•如果在F1代中混有非杂交苗，即混有突变体苗，则可能造成收集到F2代种子中混有突变体自交种（aa),使短根大于1/4，但由于这各情况造成的偏离程度无法估计，短根大于1/4也有可能只是随机分离造成的，两者无法分辨，因为F1的筛选和收种十分重要，要谨防种子污染。补充孟德尔规律•一、显隐性关系的相对性(1)完全显性：F1表现与亲本之一完全一样，而非双亲的中间型或同时表现双亲的性状；(2)不完全显性：F1表现为双亲性状的中间型。(3)共显性：F1同时表现双亲性状，而不是表现单一的中间型。RR↓rrRr↓1RR:2Rr:1rr•由于根长还受影响培养环境等影响，因为不完全显性的情况比较难判断•二、非等位基因间的相互作用无互作：9:3:3:1有互作：9：7互补作用15：1重叠作用13：3抑制作用9：6：1累加作用9：3：4隐性上位作用12：3：1显性上位作用孟德尔规律Thanksforattention.•END