姜黄素对大鼠肺微血管平滑肌细胞增殖的影响

姜黄素对大鼠肺微血管平滑肌细胞增殖的影响复旦大学附属中山医院麻醉科邮编200032张鹏黄海琼姜桢【摘要】目的：研究姜黄素对大鼠肺微血管平滑肌细胞增殖的影响。方法：实验分对照组和不同浓度姜黄素处理组。药物作用24小时后，MTT法测姜黄素对大鼠肺微血管平滑肌细胞增殖的抑制作用，流式细胞仪检测姜黄素作用后细胞周期变化。结果：姜黄素以浓度依赖的方式抑制肺微血管平滑肌细胞增殖；流式细胞仪分析显示，姜黄素处理过的细胞S期明显减少，主要停滞在G0/G1期。结论：姜黄素可以抑制大鼠肺微血管平滑肌细胞增殖，呈现浓度依赖性，其作用可能是通过阻滞细胞周期进程实现的。关键词：姜黄素；肺小血管平滑肌细胞；细胞周期Effectofcurcuminonproliferationofratpulmonarymicrovascularsmoothmusclecells【Abstract】Aim:Toexploretheeffectofcurcuminonproliferationofratpulmonarymicrovascularsmoothmusclecells.Methods:TheinhibitoryrateofratpulmonarymicrovascularsmoothcellsindifferentconcentrationsofcurcuminweremeasuredbyMTTassay.Cellcyclewasdetectedbyflowcytometry.Result:Theinhibitoryeffectofcurcuminonratpulmonarymicrovascularsmoothcellswasshowedinadose-dependentmanner(P﹤0.05).CellcycleanalysisshowedreducedpercentageofcellsinSphaseandG0/G1phasearrest(P﹤0.05).Conclusion:Curcuminexertsinhibitoryeffectonproliferationofratpulmonarymicrovascularsmoothmusclecellsinadose-dependentmannerpossiblythroughinduingcellcyclearrest.Keywords:curcumin;pulmonarymicrovascularsmoothmusclecells;cellcycle肺动脉高压发病中病理学改变主要在肺小动脉1，肺小血管出现明显的重构，内膜、中膜及外膜的内皮细胞，平滑肌细胞和成纤维细胞异常增殖，各层细胞间基质沉积2。如何抑制肺血管细胞的异常增殖，降低肺动脉压力成为治疗肺动脉高压的一项重要措施。姜黄素，中药姜黄中提取的一种酚性色素，常作为调味品及染料。近年来的研究显示在心血管系统中具有明显的保护作用，抑制主动脉平滑肌细胞的增殖3。本实验研究姜黄素对大鼠肺微血管平滑肌细胞增殖的影响。1材料和方法1.1动物、试剂及器材：健康清洁级成年SD大鼠，体重180～200g，购自复旦大学动物实验中心。胎牛血清购自Gibco公司，Ⅳ型胶原酶购自Sigma公司,姜黄素购自南京泽朗医药科技有限公司，纯度大于98%。1.2方法1.2.1肺小血管平滑肌细胞的分离培养：SD大鼠经腹腔注射10%水合氯醛（0.35-0.4ml/kg）麻醉后固定于动物解剖台上，剃去头颈及胸腹部毛发后，用碘伏及酒精棉球仔细消毒大鼠头颈及胸腹部，放入超净台内，在手术区域周围铺好无菌纱布。沿胸骨正中打开并暴露胸腔，剪开心包，静脉留置针（18号）经右心室穿刺进入肺动脉并固定，左心房开口，经肺动脉灌注37°C含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液约15～20ml/30s～1min至冲洗液为淡血水样或清亮，再灌注37°C0.05%胰蛋白酶液10ml/30s，夹闭肺动脉及左心房约8～10min；用37°C含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液约10ml冲洗后，灌注37°C含0.5%三氧化二铁和0.5%低融点琼脂糖的培液1（含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM液）15ml/kg/30s，并立即夹闭肺动脉及左心房；经气管插管灌注50°C1%低融点的琼脂糖40ml/kg后夹闭气管，迅速摘取大鼠心肺组织放入预先置于冰上的培液1中5-8min至组织中的琼脂糖凝固，沿胸膜下1mm处剪下肺组织放入另一37°C培液1中，在解剖显微镜下观察肺细小动脉，将含直径200μm肺动脉的肺叶剪除，再将剩余肺组织剪成2～3×1mm大小的碎小组织块，取1～2块碎组织块多聚甲醛固定行石蜡切片后，将剩余组织放入0.2-0.3%Ⅳ型胶原酶中37°C孵育45min-60min；用培液1反复冲洗至冲洗液清亮后，再次剪切组织块，用培液2（含20%胎牛血清的DMEM液）1～2ml混悬，放入37°C5%CO2的温箱中孵育。孵育24h后，加入20%胎牛血清的DMEM液1.5-2ml。48h后用37°C含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS液轻柔冲洗培养皿，洗去未贴壁的残余组织后加入含20%胎牛血清的DMEM液2～3ml，每隔2～3天换液。3-5天后可见部分组织块周围有梭形细胞爬出，部分区域可直接见有梭形细胞芽出，5-10天移走组织块，7～14天后可见梭形细胞爬满整个6孔板底部或其面积的80-90%，以后每隔3～7天进行一次传代。1.2.2细胞增殖抑制测定：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法，对数生长期细胞以1×103/孔接种于96孔板，细胞贴壁后无血清培养24小时，分别加入相应浓度的药物，每一浓度重复6次，共分对照组，姜黄素2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L组。放置37℃，5%CO2培养箱孵育。24小时后，吸弃上清液，加MTT液0.5mg/ml，微震荡混匀，放回37℃，5%CO2培养箱继续孵育2～3小时，然后加二甲基亚砜200μl/孔，终止反应，微震荡5min，酶标仪波长570nm测定吸光度A值，计算实验组的抑制率，计算公式为：η=（对照组A值-实验组A值）/对照组A值。1.2.3流式细胞仪细胞周期测定：对数生长期细胞1×103/平方毫米接种于六孔板，待细胞贴壁后，无血清培养24小时使细胞同步化，不同浓度姜黄素处理24小时后，以0.25%胰酶+0.2%EDTA消化贴壁细胞为单细胞悬液，与上清一并1000rpm离心10分钟收集细胞，磷酸缓冲液洗涤两遍，加入预冷的70%乙醇固定细胞，-20℃过夜，20mg/L的RNase处理30分钟，50mg/L碘化丙锭染色30分钟，流式细胞仪检测分析细胞周期分布，每组重复5次。1.3统计学分析：实验测得数据用x±s表示，采用SPSS11.0软件进行统计学分析,P﹤0.05为有统计学意义。2结果2.1不同浓度姜黄素对大鼠肺微血管平滑肌细胞增殖的影响表1示不同浓度姜黄素对肺微血管平滑肌细胞抑制率变化曲线。本研究以10%胎牛血清诱导细胞增殖，姜黄素处理24小时后，明显抑制血清诱导的细胞增殖，呈现剂量依赖性。如图所示，随着姜黄素浓度的增加，值明显下降，说明姜黄素对大鼠的肺微血管平滑肌细胞的增殖具有抑制作用。表1不同浓度姜黄素作用24小时，对大鼠肺微血管平滑肌细胞的抑制率（n=4,x±s）姜黄素（μmol/L）抑制率(%)002.58.0696±2.03682*519.2159±10.42544*1019.6265±7.23152*2029.2052±1.56854*注：与对照组（姜黄素0μmol/L）比较，*P﹤0.052.2不同浓度姜黄素对大鼠肺微血管平滑肌细胞细胞周期的影响如图2所示，不同浓度姜黄素处理过的细胞，细胞周期各时相的细胞数占细胞总数的百分比与对照组比较有明显的不同。姜黄素处理过的细胞S期明显减少，G0/G1期细胞比例增加，呈现浓度依赖性，姜黄素浓度为20μmol/L时，作用最强。表2不同浓度姜黄素作用24小时，对大鼠肺微血管平滑肌细胞细胞周期变化(n=4,x±s)姜黄素（μmol/L）S期（%）G0/G1期（%）043.8950±4.3095646.7525±5.166992.537.5550±2.9181749.6700±5.42266533.2025±2.01008*52.5175±6.565581028.0575±3.67695*56.5300±5.576972020.2675±3.87897*60.6500±5.69713注：与对照组（姜黄素0μmol/L）比较，*P﹤0.053讨论肺动脉高压可由多种疾病引起，严重的肺动脉高压极大地限制了病人的生活质量和生存时间。研究显示，在肺动脉高压诊断后如果不行治疗，平均寿命是2.8年4。在肺动脉高压的发病过程中，出现明显的肺血管重构，尤其是肺小动脉，血管壁的各层细胞增殖增大，细胞间基质沉积，炎症细胞浸润2。如何逆转或阻止肺血管的重构成为治疗肺动脉高压的一项重要措施。姜黄素，一种中药姜黄提取物，研究显示具有明显的抗炎抗氧化作用，抑制各种促炎因子的释放，清除自由基5。在心血管系统中，姜黄素具有明显的保护作用，抑制压力或药物引起的心肌肥厚，心力衰竭6；降低血清中的胆固醇浓度7，诱导血红素氧化酶-1高表达，抑制血管平滑肌细胞增殖8，保护动脉粥样硬化。姜黄素可否用于肺动脉高压的治疗，其对肺血管中的细胞增殖是否有药理作用还没有报道。我们以大鼠肺微血管平滑肌细胞为研究对象，观察姜黄素对其增殖活力的影响。研究表明，姜黄素对10%胎牛血清刺激的细胞增殖具有明显的抑制作用，随着药物浓度的增加，抑制作用增强。流式细胞仪分析显示姜黄素处理过的细胞S期比例减少，G0/G1比例增加。在细胞分裂周期内G0/G1期为DNA合成前期，为S期做准备，是细胞周期的关键和限速阶段3。本实验中各种浓度的姜黄素使大鼠的肺微血管平滑肌细胞阻滞于G0/G1期，S期的细胞数减少，打断细胞增殖的周期，抑制细胞的生长。综上所述，姜黄素通过阻滞细胞周期进程，抑制大鼠肺微血管平滑肌细胞增殖。姜黄素对肺微血管平滑肌细胞的药理作用，为进一步探索其在肺动脉高压动物模型中的应用奠定了理论基础，有望成为新型的肺动脉高压治疗药物。参考文献1.DaviesP,ReidL.Hypoxicremodelingoftheratpulmonaryarterialmicrocirculationassessedbymicrodissection.JApplPhysiol.1991;71(5):1886-1891.2.TuderRM,MareckiJC,RichterA,etal.Pathologyofpulmonaryhypertension.ClinChestMed.2007;28(1):23-42,vii.3.ChenHW,HuangHC.Effectofcurcuminoncellcycleprogressionandapoptosisinvascularsmoothmusclecells.BrJPharmacol.1998;124(6):1029-1040.4.D'AlonzoGE,BarstRJ,AyresSM,etal.Survivalinpatientswithprimarypulmonaryhypertension.Resultsfromanationalprospectiveregistry.AnnInternMed.1991;115(5):343-349.5.ItokawaH,ShiQ,AkiyamaT,etal.Recentadvancesintheinvestigationofcurcuminoids.ChinMed.2008;3:11.6.MorimotoT,SunagawaY,KawamuraT,etal.Thedietarycompoundcurcumininhibitsp300histoneacetyltransferaseactivityandpreventsheartfail