在职研究生分子生物学部分课后思考题

《基因组学与后基因组学》说明人的基因组成或结构变化所引起的相关疾病。要求：1、特定某个基因名称、定位、大小及组成等基本特征。2、基因组成或结构变化的过程、结果和表型。《细胞信号转导》1、请叙述肝细胞对胰高血糖素或肾上腺素的反应过程。举胰高血糖素的例子：胰高血糖素与受体结合受体蛋白分子发生构象上变化受体与G蛋白αs亚基结合α亚基与GDP亲和力下降与GTP亲和力增加，GTP置换GDP-α亚基变构，α与β、γ分离，同时α与受体分离（G蛋白至功能状态）-活化的G蛋白与AC结合，激活之-AC催化ATP分解形成cAMP（第二信使）cAMP活化cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）使靶蛋白磷酸化-肝细胞糖原分解、糖异生、减少对葡萄糖的利用。2、细胞膜在信号转导的过程中起到怎样的作用？细胞通过位于胞膜或胞内的受体感受胞外信息分子的刺激，经复杂的细胞内信号转导系统的转换而影响其生物学功能，这一过程称为细胞信号转导，这是细胞对外界刺激做出应答反应的基本生物学方式。其中，水溶性信息分子如肽类激素、生长因子及某些脂溶性信息分子(如前列腺素)等，不能穿过细胞膜，需通过与膜表面的特殊受体相结合才能激活细胞内信息分子，经信号转导的级联反应将细胞外信息传递至胞浆或核内，调节靶细胞功能，这一过程称为跨膜信号转导。其过程包括：①胞外信号被质膜上的特异性受体蛋白识别，受体被活化；②通过胞内信号转导物(蛋白激酶，第二信使等)的相互作用传递信号；③信号导致效应物蛋白的活化，引发细胞应答(如激活核内转录因子，调节基因表达)。脂溶性信息分子如类固醇激素和甲状腺素等能穿过细胞膜，与位于胞浆或核内的受体结合，激活的受体作为转录因子，改变靶基因的转录活性，从而诱发细胞特定的应答反应。细胞信号转导异常与疾病细胞信号转导异常：是指由于信号转导蛋白量或结构的改变，导致信号转导的过强或过弱，并由此引起细胞增殖、分化、凋亡或机能代谢的改变。受体的缺陷重症肌无力（myadstheniagravis）：�患者体内产生了抗乙酰胆碱受体的抗体�抗体与乙酰胆碱受体结合，封闭乙酰胆碱，并促使乙酰胆碱受体的分解�患者体内受体的数目明显减少�通过乙酰胆碱受体进行的信号转导过程障碍，而出现病症。G蛋白功能异常�霍乱：霍乱弧菌附于小肠粘膜进行繁殖而引起的急性腹泻�霍乱弧菌产生的霍乱毒素，可与Gs的α亚基结合�α亚基丧失了GTP酶活力，不能将GTP水解成GDP�Gsα处于不可逆激活状态,不断刺激AC生成cAMP,胞浆中的cAMP含量可增加至正常的100倍以上�导致小肠上皮细胞膜蛋白构型改变，大量氯离子和水分子持续转运入肠腔，引起严重腹泻和脱水。肢端肥大症和巨人症�垂体腺瘤：分泌生长激素（GH）过多�编码Gsα的基因突变（30~40%）：Gsα的精氨酸201被半胱氨酸或组氨酸取代;或谷氨酰胺227被精氨酸或亮氨酸取代�突变抑制了GTP酶活性，使Gsα处于持续激活状态，cAMP含量增多，垂体细胞生长和分泌功能活跃。先天性肾源性尿崩症(CNDI)－遗传性疾病主要症状：肾脏集合管对抗利尿激素不起反应而致尿浓缩障碍，出现多饮、多尿和尿比重降低。患病的婴儿的肾脏缺乏产生终尿的能力，他们会遭受到严重的脱水。慢性的的脱水会引发智障碍、生长迟缓、甚至是死亡.1、试述外源基因在原核体系中的表达需要具备的条件，及影响外源基因表达的因素。条件：编码区不含插入序列；（mRNA-cDNA）位于启动子下游，方向一致，原有的读码框不变；含起始密码子、终止密码子；转录出的mRNA必须有SD序列，调整SD序列与第一个AUG间的距离（因为会对转译效率有影响）；产物比较稳定（如：融合蛋白、信号肽）；选择系统偏好的简并密码。影响因素：启动子的强弱（主要因素）基因的剂量RNA转译效率（SD互补、AUG-SD距离及序列、AUG前后核苷酸序列的适宜性）密码子表达产物的大小产物的稳定性2、蛋白质的分离纯化技术依据蛋白质的性质分为哪几大类，请列举其中的一类，谈谈它的原理及应用。分类溶解度差别：如：硫酸铵沉淀法分子大小不同：透析、超过滤、离心、凝胶过滤（分子筛层析）蛋白质分子带电性质不同：电泳、离子交换层析蛋白质吸附性质不同：根据蛋白质吸附性质不同的分离方法。原理：利用不同的蛋白质被吸附剂吸附的强弱不同，在洗脱中吸附弱的物质先被洗脱，吸附强的后被洗脱。吸附剂①无机（活性炭、硅胶、氧化铝）②有机（淀粉、聚酰胺凝胶、纤维素）。类型：吸附柱层析、吸附薄层层析。应用：可用于纯化生命物质、分离蛋白质亚基、浓缩溶液等。蛋白质的特异性配体3、以人GM-CSF为例，写出获得该基因工程重组蛋白纯品的流程。技术路线-表达载体的构建、外源基因片段的分离-表达性重组体的构建-转化宿主菌-诱导表达-表达产物的鉴定-表达产物的分离-对粒细胞作用的体内外实验。引物设计-表达载体1.GM-CSF全基因PCR扩增提取正常人外周血粒细胞总RNA，GM-CSF全基因的获得，以该总RNA为模板，用宝生物公司的BeaBEST反转录试剂盒进行反转录。以该反转录产物为模板，加入引物P1，P2进行第一次PCR。GM-CSF基因的获得以GM-CSF全基因经纯化的PCR产物为模板，加入引物P1，P2，再次PCRGM-CSF基因，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。2.含肠激酶位点的pThioHisA--sTRAIL表达载体的构建纯化后的GM-CSFPCR产物用BamHI、EcoRI双酶切。质粒pThioHisA用同样的酶双酶切，胶回收酶切片段，T4DNA连接酶分别连接经双酶切的片段GM-CSF和质粒载体，转化宿主菌BL21，筛选阳性克隆。小提质粒，酶切鉴定重组子，并对重组子进行测序分析。3.诱导表达GM-CSF在大肠杆菌BL21中的诱导表达。3.0mmol/LIPTG诱导6-8h，表达达到高峰，经薄层扫描目的蛋白约占菌体总蛋白的39％左右。表达产物部分可溶，其余形成包涵体。融合表达产物SDS-PAGE表观分子量为32000Dalton左右（实际分子量为35608.21Dalton）。4.GM-CSF融合蛋白的制备工程菌的培养：挑取阳性克隆，接种于200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜。然后以10-20％的接种量扩大培养，IPTG诱导。超声破碎菌体离心收获的菌体按0.2g/mL重悬于A液(20mmol/LTris-HClpH8.0，0.2mol/LNaCl，5mmol/L咪唑)，浴中超声破碎。12,000rpm/min离心15min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析目的蛋白以可溶性还是以包涵体形式存在。5.sTRAIL融合蛋白的纯化融合表达载体pThioHisA在硫氧还蛋白融和段带有组氨酸标签，用Ni2+固相化的ChelatingSepharoseFastFlow填料进行亲和层析。将可溶性表达产物（超声破碎菌体的离心上清）与亲和柱结合，用2倍柱床体积以上的A液过柱，至基线平稳；用B液(A液中加入咪唑至终浓度为50mmol/L)梯度洗脱5－10个柱体积，用AKATAExplore进行检测，收集各洗脱峰。6.sTRAIL融合蛋白的肠激酶切割及纯化。7.sTRAIL融合蛋白及非融合蛋白的WesternBlot检测。《RNAi的机制及应用》《基因表达的调控》1、什么是基因表达？试述基因表达的特点及其调控对生物体的重要性。基因表达(geneexpression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。特点：1）.组织特异性（tissuespecificity）——不同组织细胞中不仅表达的基因数量不同，而且基因表达的强度和种类也各不相同；2）.阶段特异性（stagespecificity）细胞分化发育的不同时期，基因表达的情况不同；3）.与环境相适应当周围的营养、湿度、酸度及个体条件变化时，生物体就要改变自身的基因表达状况，以调整体内执行和相应功能的蛋白质的种类、数量，从而改变自身的代谢活动度以适应环境。对生物体的重要性：适应环境、维持生长、增殖和维持个体发育与分化。生物的基因表达不是杂乱无章的，而是受着精密精确调控的。生命的遗传信息是生物生存所必须的，而且遗传信息的表达调控也是生命本质所在。2、真核生物中，基因的表达受不同水平的调控，请列举其中三种。A.转录前调控：基因丢失；（原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物）转录前调控，非洲爪蟾的卵母细胞中原有的rRNA基因约500bp，卵裂期和胚胎期需要大量的rRNA，基因会大量复制rRNA，使拷贝数达到200万倍，扩增约4000倍。基因扩增（geneamplification）基因重排（gene；rearrangement）。DNA的甲基化（DNAmethylation）组蛋白修饰（Histonemodification）B转录水平的调控：转录调控是通过各种调控元件相互作用来实现的，调控元件主要包括顺式作用元件和反式作用因子。C转录后调控：hnRNA的选择性加工运输；mRNA前体的选择性剪接RNA编辑；RNAiD.翻译调控：翻译因子的磷酸化调控；mRNA稳定性调控E.翻译后调控－蛋白质修饰3、为什么说转录起始的调控是基因表达调控的中心环节？因为基因表达是通过转录和翻译，将DNA上的遗传信息转变为RNA和蛋白质的过程，所以转录是基因表达的第一步，尤其是转录起始阶段。转录起始受到严格的控制，转录起始的重要元件是启动子，它必须与RNA聚合酶准确地结合才有活性。此处，这个过程还将受到一系列转录因子的相互作用，这些转录因子决定着靶因基因转录的速度和数量。因为是表达的初始阶段，可以避免那些不需要的转录所造成的资源浪费。4、例举说明DNA甲基化与肿瘤的关系。通常DNA的正常甲基化与正常胚胎发育生长等有关，影响基因表达，调节染色质结构，与DNA损伤和修复过程有密切的关系。还参与了DNA复制和包装及DNA片段的转移等。肿瘤的甲基化状态改变包括基因组整体甲基化水平降低、正常非甲基化CpG岛的高甲基化和维持甲基化模式酶的调节失控。DNA的甲基化修饰通过改变基因的表达，参与了细胞的生长、发育过程及X染色体失活等的调控。在细胞正常发育基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用。一旦异常，在胚胎时期，基因组范围的DNA甲基化模式异常会导致胚胎死亡。而在成体中异常甲基化则意味着疾病，告别是肿瘤的发生。癌基因甲基化被激活，抑癌基因高甲基化被沉默。《表观遗传学》1、简述CRISPR/Cas-9的基本原理及优点（与传统的基于同源重组的胚胎干细胞基因敲出相比较）。2、为何在筛选靶基因敲除的胚胎干细胞时还需经历阴性筛选过程？简述更昔洛韦（Ganciclovir）在胚胎干细胞阴性筛选中的作用机制。《细胞凋亡》1、什么是细胞凋亡？2、细胞凋亡有哪两条主要的途径？1、原癌基因活化的机制。1）点突变：放射线或化学致癌物引起的基因单个碱基改变。2）基因扩增：细胞通过增加基因拷贝数，使表达产物增多的过程。3）DNA重排：同一染色体上基因的重新排列组合。4）染色体异位：不同染色体断裂后重新连接不正确，如IgH基因转录活化部位和bcl2基因相连。5）病毒基因启动子及增强子的插入。2、P53基因的作用机制。p53的两大功能：使细胞在G1期停滞。当DNA损伤后，p53首先诱导细胞进入G1期，抑制细胞增殖，直至损伤的DNA修复。一旦DNA不能被修复，p53就会活化那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞发生凋亡。3、肿瘤基因诊断的基本策略。4、基因诊断的基本策略。1）、检测已知的能产生某种特定功能蛋白的基因。这些基因根据其特定功能已被克隆，并被定位在染色体上，基因序列亦被测定，致病时的基因改变亦较清楚。2）、检测与某种遗传标志连锁的致病基因。①遗传连锁－－同一染色体相邻的二个或二个以上的基因或限制性酶切位点，由于位置十分靠近，在遗传时分离几率很低，常一起遗传------称连锁。②染色体遗传连锁图－－用限制性内切酶酶切位点作遗传标志，定位与之相连锁的正常基因与致病基因，建立相应的遗传连锁图谱