原生质体诱变方法

2.4试验方法2.4.1酶液配制称取适量固体酶（w/v)，溶于0.6mol/L渗透压稳定剂中，0.22μm微孔过滤膜过滤除菌后备用。2.4.2菌丝培养取直径1cm的菌丝块接种于盛有100mL液体培养基的250mL三角瓶中，每瓶接种一块，25℃静置培养3-7d。2.4.3原生质体制备与计数将培养好的菌丝置于离心管中，10000r/min离心15min，弃去上清液，用相应稳渗剂洗涤3次，无菌滤纸吸去多余水分。每250mg湿菌丝加1mL酶液，在适当温度水浴中酶解一段时间，酶解过程中每隔一段时间震荡混匀一次，吸取少许酶解液，血球计数板计数。原生质体制备是菌种选育及其遗传研究的一个重要组成部分，确定了滑菇原生质体形成的最适条件：以0.6mol/L的MgSO4为稳渗剂，在2%的蜗牛酶和纤维素酶的混合酶、pH6.5、酶解温度30℃的条件下对培养7d的菌丝进行酶解，在此条件下所得原生质体的产量为3.92×106个/mL。1.5.3原生质体再生1.5.3.1原生质体纯化（崔宗强，2003）酶解后的原生质体悬浮液经脱脂棉柱（5mL注射器中塞入0.5-1.0cm高的脱脂棉，稍压实）过滤除去残余菌丝，滤液4200r/min离心10min，去上清液，用渗透压稳定剂洗2次，得到纯化原生质体。吸取少许悬液，血球计数板计数。1.5.3.2原生质体再生将适量原生质体悬液稀释到一定浓度后，吸取0.1mL涂布再生固体平板。同时用无菌水涨破原生质体后，以同样方法涂布再生固体平板，以消除非原生质体所形成的菌落带来的误差。原生质体再生率的计算：再生率（％）＝（原生质体再生菌落数－对照组再生菌落）/原生质体总数×100％。1.5.3.3再生培养基的选择在30℃、pH6.0、1.5%酶液条件下，以0.6mol/LKCl作为稳渗剂，酶解3h得到冬虫夏草原生质体。将所得原生质体过滤、纯化后吸取0.1mL分别涂布5种不同再生培养基，25℃培养5d。1.5.2.1质生质体的紫外线诱变处理照射前，先打开石英紫外光管预热20min，使光波稳定。诱变过程应在黑暗条件下进行，将制备好的原生质体稀释至106个/mL，取5mL放于无菌的9cm平皿内，置于电磁搅拌器上，使原生质体悬液保持均匀。紫外灯功率15W，照射距离30cm，照射0－100s。照射后适当稀释，取1mL涂平板，黑暗闭光于25℃恒温箱中培养，待平板长出菌落后，计菌落数，并计算原生质体紫外线诱变的半致死剂量。1.5.2.2冬虫夏草原生质体诱变效应曲线及紫外线诱变剂量的选择取22个9cm平皿，每皿分别装有新制备的106个/mL的冬虫夏草原生质体悬液5mL。共分为11组，每组2个重复。紫外灯功率15W，照射距离30cm，分别照射0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100s。然后分别每皿取1mL，适当稀释后涂再生平板。平板用黑布包裹后，置于黑暗闭光的25℃恒温箱中培养。待平板长出菌落后，计菌落数。每组以两个皿菌落数的平均值作为该组的菌落数。以照射时间为横坐标，以再生菌落数为纵坐标，绘制冬虫夏草原生质体紫外诱变剂量效应曲线。1.5.3冬虫夏草诱变株的筛选以半致死剂量对应的紫外线照射剂量诱变冬虫夏草原生质体，连续诱变20批，每批稀释后涂10个平皿。待原生质体在平皿上再生出菌落后，取优先再生出来、生长最旺盛的菌落，转接入PDA培养基平皿内。采用三点接种法，每皿分别接种2株诱变菌株和1株原始出发菌株，根据拮抗反应和生长状况筛选出100株诱变菌株。1.5.4虫草多糖含量测定1.5.4.1液体菌种制备分别取100株诱变和原始出发菌株直径10mm的菌种块接入盛有100mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，25℃，160r/min振荡培养4d，得液体培养液。1.5.4.2胞外多糖（EPS）含量测定1.5.4.2.1苯酚溶液的配置称取50g苯酚于1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，置棕色瓶中，配成5％苯酚溶液，避光保存。