双向琼脂扩散实验

双向琼脂扩散试验一、实验目的1、掌握双向琼扩试验的原理和用途2、掌握双向琼扩试验操作方法3、观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线二、原理血清学反应：•凝集反应•沉淀反应•补体参与的反应•中和反应凝集反应：颗粒性抗原，或吸附在颗粒性载体表面的可溶性性抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在，经过一定时间，成肉眼可见的凝集团块参与凝集反应的抗原称凝集原，抗体称为凝集素沉淀反应：将可溶性抗原与相应抗体混合，在电解质存在条件下，即可形成肉眼可见的沉淀物沉淀物只在抗原抗体比例合适时才出现补体参与的反应：补体结合试验是根据补体能与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独同抗原或抗体结合的特性，用特定的补体来检测抗原抗体间有无特异性结合中和反应：针对病毒的一些蛋白质抗原或抗原表位的抗体与病毒结合后可以中和病毒的感染性（病毒中和试验可以在细胞培养、鸡胚或动物上进行，一般将抗体作稀释，与一定量的病毒混合，然后检测其在细胞培养、鸡胚或动物上的残余感染性）•终点是以抑制细胞病变（细胞培养）或病毒复制（鸡胚或动物）的抗体最高稀释度来表示。（中和试验具有很强的特异性，是检测病中和试验具有很强的特异性，毒和新分离病毒毒株的鉴定最经典的方法，也可用于检测病毒感染动物血清中的抗体）双向琼脂扩散试验，是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。两者相互扩散，当扩散到他们的浓度比例合适的部位相遇时，就会形成抗原抗体复合物的沉淀【可溶性抗原（如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等）与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以，可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。】三、实验材料Ag（实验所提供的抗原）Ab（实验所提供的抗体血清）1%琼脂玻片、打孔器、加样器、tip头等四、步骤1、称取1g琼脂粉，加至100ml8%高渗盐水中，配制1%琼脂凝胶隔水煮沸使其溶化稍冷至55℃后浇板(用吸管吸取4ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板）注意载玻片应放水平，琼脂勿倒出板外。2、待凝固后在琼脂上打梅花孔（孔数孔径孔距根据实验情况待定）孔内的琼脂如未吸出，则用注射器针头挑出孔中琼脂。3、封底：将玻片于酒精灯上烘烤背面（温度不宜过高，以不烫手为宜），使琼脂与玻片紧贴；将抗体按二倍比稀释法稀释成1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，中间孔加抗原，周围孔加倍比稀释抗体，其中一个孔加滴入生理盐水作为对照（小心加样，不要溢出）4、置37℃湿盒24-48h结果观察：在抗原抗体比例合适处，出现白色沉淀，以出现明显的沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。