反卷积简介

反卷积简介反卷积是一种计算密集型图像处理技术，通过该技术，可以提高显微图像的对比度和清晰度。物镜数值孔径受限的情况下，这项技术主要是依靠一系列去模糊处理技术来提高图像的质量。基本上所有通过数码荧光显微镜拍摄的图像都可以反卷积处理。还有一些新的技术将反卷积应用在透射光图像中。在所有反卷积技术的研究应用中，3D成像是最常用到反卷积处理的。图1标注了反卷积处理中需要用到的光学元件。样品是一个理想的细胞，由普通光学显微镜延Z轴获得一系列光切图（右图）重建形成。在每一个焦平面上，相对应的平面图像被探测器记录并保存在计算机中。在反卷积分析中，每一个焦平面上的图像被处理重建为一个3D图像。反卷积技术常被认为是共聚焦显微镜的很好的替代品。严格来说这种说法并不准确，因为利用针孔光阑获得的共聚焦图像也可以用反卷积技术分析。然而，文献中记载的大部分涉及反卷积技术的实验，都是应用于宽场荧光显微镜上的。当今反卷积算法处理的图像可以跟共聚焦拍摄的图像相媲美。事实上，共聚焦显微镜与宽场反卷积处理显微技术都可以去模糊，但工作原理是相反的。共聚焦显微镜是通过安装在物镜和检测器之间的针孔光阑，来阻止非焦平面上的模糊图像，而只有焦平面上的光可以通过。相反，宽视场显微镜允许探测器接收到的所有光通过，随后利用反卷积技术对获得的图像去模糊处理。共聚焦显微镜尤其适合观察厚的样品，比如胚胎或者组织；而宽视场反卷积显微镜很适合拍摄在非常低光水平的样品，比如荧光标记的活细胞和核酸。图像降质的原因图像降质可分为4个独立的原因：噪声，散射，眩光和模糊。图2分别展示了上述4种原因造成的图像效果。反卷积技术的主要任务就是去除非焦平面上的模糊。反卷积算法确实可以去除噪声，但只是整体上相对简单的去除。1.噪声。噪声通常被描述为图像细节的拟随机紊乱（quasi-randomdisarrangement），最严重的形式就是白噪声（whitenoise）或者黑白相间噪声（salt-and-peppernoise），就是类似于电视中图像信号不好导致屏幕上的雪花点（图2(a)）。这种类型的噪声被定义为拟随机，是因为如果噪声的来源是已知的，那这种噪声的分布是可以预测的。在数码显微镜中，噪声的主要来源是信号自身（光子噪声）或者成像系统。噪声产生的两种原因已经了解，因此对噪声的分布统计也是可知的。信号产生的噪声呈泊松分布（Poissondistribution），而成像系统产生的噪声常常呈高斯分布（Gaussiandistribution）。因为噪声产生的这两种原因已经了解的非常清楚，因此通过使用合适的图像过滤器可以很容易的去除，这在很多反卷积处理的软件中都可以做到，是一个可选的图像预处理过程。2.散射。散射常指的是由于样品的异质折射率而引起的光的随机干扰。散射会引起图像细节真正的随机紊乱，如图2（b）。虽然样品中的散射并没有一个满意的预测方法，但是研究表明，散射的程度与样品的厚度和样品周围包埋材料的光学特性密切相关。散射随着样品的厚度和样品内部结构的散射率异样性而增加。3.眩光。与散射类似，眩光也是由光的随机扰动引起的，但常常由光学元件（如镜头、滤光片等）引起而不是样品本身。当今的显微镜，通过对镜头和滤光片的抗反射涂层，镜头细化成像技术，光学用胶合剂和玻璃成分等的改进，眩光的程度已经降到最低。图2(c)就是一个典型的眩光图像。4.模糊。模糊是光通过成像系统的光学镜片组件时的非随机扩散引起的（图2(d)）。模糊产生的主要原因是光的衍射，仅仅由于模糊引起的图像分辨率受限，被称为衍射限制（diffraction-limited）。它代表了任何一个成像系统固有的局限，而且是评价一个光学系统的像素有限性的决定性因素。光学原理中阐述的非常复杂的模糊模型，在高速计算机的帮助下可以应用在光学显微镜的成像上。这就是反卷积的基本依据。因为模糊在反卷积中的基础重要性，它的理论模型在本文的其他段落有详细讨论。然而，需要强调的是，所有的成像系统产生模糊，跟样品或者机械电子元件引起的图像降质形式完全无关。这种光学模糊跟其他类型的图像降质无关，使得反卷积去模糊成为可能。光和物体的相互作用主要源于物理现象，如散射、眩光和模糊。但是，一个特定材料中的分子的组成和排列（无论是玻璃，水或者蛋白）都有特定的光学特性。反卷积的目的，就是区分散射、眩光和模糊发生的位置及产生这些现象的数学模型的可能性。因为散射在样品中发生位置不固定，所以被认为很难建模。相反，因为模糊是显微镜光学系统的作用，所以很容易建模。这样的模型使得去模糊成为可能，反卷积可以使用这个模型去模糊。点扩散因子（PSF）模糊的模型上升到理论光学上是以3D点扩散因子的概念为基础的。这个概念是反卷积的重要基础，为了避免图像伪影，更需要深入了解这个概念。点扩散因子是建立在样品空间的小点光源的无限扩散基础上。因为显微成像系统在这一点上仅仅收集到部分发射光，而这种光不能完美的集中在3D图像的点上。取而代之的是，这一点显示较宽而呈三维扩散方式。因此，点扩散因子是用来形容一个理想点光源的3D衍射类型。以已有的成像模式为基础（宽视场，共聚焦，透射光），点扩散因子有不同的形状和结构。在宽视场荧光显微镜中，点扩散因子的形状类似于被一团宽的光环包围的椭圆形足球。为了在三维空间上描述点扩散因子，通常使用3轴坐标系统，其中x和y轴是样品焦平面的坐标轴，而z轴与显微镜光轴平行。在这种情况下，点扩散因子表现为一系列x-y轴同心的环，见图3。在宽视场的点扩散因子中心的x-y轴纵切图像中显示为一系列x-y轴同心的环，在经典的光学显微镜文献中被称为艾里斑（Airydisk）。两个x-z投影的点扩散因子显示出不同的球面像差（图3）。光轴与图像垂直的轴平行。左图中的点扩散因子展示了最小的球差，而右图中的点扩散因子球差非常大。需要注意的是，右图中，轴不对称和沿光轴中间的节点增宽，会引起轴向分辨率的降低和信号的模糊。理论上说，点扩散因子的大小是无限的，远离焦平面的总光强度与焦平面的光强度是相同的。但是，光的强度降低很快，最终会变得跟噪声分不开。使用高数值孔径的油浸物镜（1.40），无像差的点扩散因子，在焦平面占用0.2μm2，扩散超过90次，在焦平面上下扩散到1mm范围内。记录这些点扩散因子图片所用的样品是悬浮在甘油中（折射率=1.47）0.1mm直径的荧光点，镜油的折射率在图中标示出来了。点扩散因子如何影响成像是一个重要的考虑因素。图像形成的理论模型将点扩散因子作为图像的基本单元。换句话说，点扩散因子对于图像来说相当于砖头对于房子的作用。最好的图像就是点扩散因子的集合，增加放大倍数不会改变这个事实。在《光学原理》一书（BornandWolf:PrinciplesofOptics）中有阐述“通过增加目镜的倍数，并不会增加原始图中没有的细节，因为原始图像的每一个部分都是一个小的衍射图，而从目镜看到的实际图像是放大图像的集合”。举例来说，要考虑在盖玻片和载玻片之间微小的荧光点的数量。焦平面上的样品图像呈星点云状，当用高分辨率观察时，每一个点实际上就是一系列小的同心环（图4(a)）。如果稍微偏离焦平面，很多更大的同心环就会在刚才的成像位置显示（图4(b)）。在收集3D图像的时候，每一个荧光点的完整的点扩散因子被记录。点扩散因子描述了通过成像系统中光的每一个点的情况。模糊过程就是卷积的数学模仿。卷积运算时描述样品中每一个点的点扩散因子。来自每一个点的发射光是对点扩散因子的卷积运算，产生最后的图像。不幸的是这个卷积出来会使样品图像变成模糊区域。图像中每一个点的亮度与样品中每一个荧光点的卷积运算线性相关。因为点扩散因子是三维的，点扩散因子的模糊在三维图像中固有的。任何一个焦平面的图像包含了该平面的点模糊和其他平面的点。总的来说，图像的形成是由样品的点扩散因子的卷积计算获得的。反卷积与这个过程相反，试图从模糊图像中重建清晰图像。点扩散因子中的像差点扩散因子被定义为理论上利用衍射的数学模型，或者经验上获取荧光点的三维图像（见图3）。一个理论上的点扩散因子通常有轴向对称和径向对称。实际上，点扩散因子是在x-y轴上面或者下面的对称（轴向对称）和z轴对称（径向对称）。一个经验上的点扩散因子可以有完美的对称衍生出（见图3）。这种衍生，通常指的是像差（Aberration），由成像系统光学套件中任何一个部分的不规则或不对称引起，尤其是物镜，但是其他部分也能引起像差，比如，反射镜、分光器、滤光片、光阑、孔径等。光学组件的质量越好，经验点扩散因子越能接近理想的对称状态。共聚焦和反卷积显微镜技术中的点扩散因子都与理想值非常接近。很多有经验的专业显微镜使用者都了解，光学显微镜中最常见的像差是球面像差。球差表现为点扩散因子形状的轴向对称，尤其延z轴，同时大小增加，（图3）。结果是分辨率和信号强度严重降低。实际上，球差最常见的来源是由物镜前镜头浸入的基质的折射率和样品浸入的基质决定。如何减少无处不在的像差至关重要。虽然反卷积技术可以部分恢复失去的分辨率，但是，即使再多的图像处理过程也不能恢复丢失的信号。