发酵工程第5章发酵工业的种子制备

第五章发酵工业的种子制备本章内容第一节种子制备概述（目的、要求、举例）第二节种子制备技术第三节影响种子质量的因素第四节种子质量的控制措施将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。种子培养的目的与要求种子培养的概念(P78):这些纯种培养物称为种子。种子扩培的目的接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间、保证生产水平种子的要求：总量及浓度能满足要求生理状况稳定，个体与群体活力强，移种至发酵后，能够迅速生长无杂菌污染菌种适应性强，能保持稳定的生产能力1、斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5%琼脂2%，pH7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-24小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次种子制备举例一、谷氨酸2.一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12小时。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，K2HPO40.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基3.二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32℃培养7-10个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基种子的质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛二、青霉素生产的种子制备制备过程安培管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵1、斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养条件：25℃、7天,注意湿度50%左右2、大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。培养条件：25℃、7天，控制湿度大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子3、一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目的：长菌体培养条件：27℃，40小时接种量：200亿孢子/吨4、二级种子培养基：同上培养条件：27℃、10-14小时接种量：10%种子的质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于Ⅲ—Ⅳ期青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强第二节种子制备的技术一、种子制备的过程实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。二、实验室阶段1、培养物选择的原则目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：对于不产孢子的微生物——获得一定数量和质量的菌体对于不产孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。对于产孢子的微生物获得一定数量和质量的菌丝体便于操作，但需要更仔细的控制。2、培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。3、起始接种物的传代问题细菌保藏斜面→活化斜面产孢子保藏→母斜面→子斜面目的：使菌种的传代次数尽可能的少。母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去除变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接种：①从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落②接种时密一点，得到大量的孢子。孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月孢子培养三、生产车间阶段1、培养物的选择原则在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。缩短发酵时间有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利：2、培养基选择的原则目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本二是驯化例：柠檬酸发酵以蔗糖为原料成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁蔗糖2.5-5%20%NH4NO30.225%0.11%K2HPO40.03%MgSO4.H2O0.025%0.025%KCl0.015%琼脂2%薯干粉成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁薯干粉10%22-28%(NH4)2SO40.5%琼脂2%3、发酵级数的确定谷氨酸：三级发酵一级种子（摇瓶）→二级种子（小罐）→发酵青霉素：三级发酵一级种子（小罐）→二级种子（中罐）→发酵一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数。发酵级数确定的依据级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。4、接种量的确定移入种子的体积接种量＝—————————接种后培养液的体积过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。5、种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好6、种子的质量要求：量：要求达到一定的浓度质:形态(生长处于某个阶段、均匀等）、理化指标（C、N、P的含量）、pH、酶活等无污染种子异常分析菌种生长速度，过快或过慢与孢子质量及种子罐的培养条件有关无菌空气温度较低或者培养基的质量较差培养基灭菌后需取样测定其pH值，以判断培养基的灭菌质量种子异常分析菌丝结团在液体培养条件下，繁殖的菌丝并不分散舒展而聚成团状称为菌丝团。菌丝聚集成团会影响菌的呼吸和对营养物质的吸收种子液中的菌丝团较少，进入发酵罐后，在良好的条件下，可以逐渐消失，不会对发酵造成显著影响菌丝团较多，种子液移入发酵罐后往往形成更多的菌丝团，影响发酵的正常进行。种子异常分析菌丝粘壁菌丝粘壁是指在种子培养过程中，由于搅拌效果不好，泡沫过多以及种子罐装料系数过小等原因，使菌丝逐步粘附在管壁上，其结果使培养液中菌丝浓度减少，最后就可能形成菌丝团以真菌为产生菌的种子培养过程中，发生菌丝粘壁的机会较多第三节影响种子质量的因素原材料质量培养温度湿度通气与搅拌斜面冷藏时间培养基pH原材料质量原材料质量波动引起种子质量不稳定原材料质量波动的主要原因：无机离子含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也会影响孢子的质量）。培养温度温度过低，菌种生长发育缓慢温度过高会使菌丝过早自溶在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。湿度湿度低，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢制备土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子时发现，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干瘪状，孢子稀少。通气与搅拌足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会，增加能耗。丝状微生物不宜剧烈搅拌。斜面冷藏时间对孢子的生产能力有较大影响冷藏时间越长，生产能力下降越多链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％，比冷藏3个月的降低35％。培养基培养种子的目的：扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足氮源和生长因子，无机氮源比例大；各种营养物质的浓度不必太高；供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源；应考虑与发酵培养基的主要成分相近。种子培养基特点pH选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量培养最后一级种子的培养基的pH应接近于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境第四节种子质量的控制措施菌种稳定性的检查测定其生产能力，从中挑选高产菌株，并及时对退化菌种进行复壮提供适宜的生长环境种子无杂菌检查，保证纯种发酵。种子液生化分析项目主要有：营养基质的消耗速度、pH变化、溶氧变化、色泽和气味等细菌发酵时的种子扩大培养；细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目的是为了获得大量的活力强的种子；种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接种物含大量芽孢，将给后续发酵带来较长迟滞期梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮时种子扩大培养的程序举例：酵母发酵时的种子扩大培养酿酒酵母的扩大培养最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵母繁殖流程，他将每一步的接种量规定为10％，并控制繁殖条件与酿造时一致现代的流程中，接种量为1%或更低，控制的条件也与酿造时不同。面包酵母时的种子扩大培养的程序丝状真菌发酵的种子扩大培养丝状真菌既可以利用孢子，也可以利用菌丝体作为接种物接种到发酵罐进行发酵在固化的培养基上产生孢子“滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生产在固体培养基上产生孢子在谷类的颗粒表面形成大量的孢子在液体深层培养基中产生孢子利用孢子作为接种物灰黄霉素产生菌展青霉一试验表明在良好的通气条件下，培养基中含氮是在0.05～0.1％（w/v）之间时，可以产生大量的孢子丝状真菌的菌丝体作为接种物不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为接种物，如生产赤霉素的菌种——藤仓赤霉问题：难以获得均一的接种物接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝段，它具有大量的生长点放线菌发酵时的种子扩大培养斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子本章要求：2.掌握种子扩培目的及种子需要满足的要求;1.基本概念:种子的扩大培养,接种龄,接种量,级数,倒种,双种3.掌握种子制备过程和影响因素本章小结掌握有关无菌技术的基本概念了解发酵工业污染的原因及其防治策略掌握培养基及设备灭菌的基本原理、基本方法及灭菌时间的估算实罐灭菌、连续灭菌定义，比较掌握空气除菌基本原理、流程及空气预处理设计