叶绿体的分离与荧光观察

山东大学实验报告2014/11/18姓名：XXX系年级：20XX级齐鲁医学班学号：201XXXXXXX科目:细胞生物学实验实验题目:叶绿体的分离及荧光观察叶绿体的分离及荧光观察【实验目的】1.学习使用差速离心法获取叶绿体2.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。3.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。【实验原理】1.高等植物中叶绿体象双凸或平凸透镜，长径5—10um，短径2-4um，厚2-3um。高等植物的叶肉细胞一般含50-200个叶绿体，可占细胞质的40%。、叶绿体的数目因物种细胞类型，生态坏境，生理状态而有所不同。在藻类中叶绿体形状多样，有网状，带状，裂片状和星形等等，而且体积巨大，可达100um.叶绿体由叶绿体外被，类囊体和基质3部分组成。叶绿体含有3种不同的膜：外膜，内膜，类囊体膜和三种彼此分开的腔：膜间隙，基质和类囊体腔。2.匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒。收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。差速离心法：颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。3.差速离心法特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心用途：分离大小相差悬殊的细胞核细胞器沉降顺序：核——叶绿体，线粒体——溶酶体与过氧化物体——内质网与高尔基体——核蛋白体可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。【实验材料】1.试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙。2.器具：粗天平、组织捣碎机、普通离心机、普通光学显微镜、荧光显微镜、500ml烧杯、量筒、滴管、10ml刻度离心管、纱布若干，试管架、无荧光载玻片和盖玻片。3.材料：新鲜菠菜。【实验步骤】山东大学实验报告2014/11/18姓名：XXX系年级：20XX级齐鲁医学班学号：201XXXXXXX科目:细胞生物学实验实验题目:叶绿体的分离及荧光观察1.选取新鲜嫩滤菠菜叶，去除叶梗及粗脉，洗净擦干，称30g于150ml0.35mol/LNaCI溶液中；2.将叶和液同装入组织捣碎机中，匀浆3-5min，转速5000r/min；3.将匀浆液用6层纱布过滤到500ml烧杯中；4.取滤液4ml在1000r/min下离心2min；5.取上层清液在3000r/min下离心5min（沉淀为叶绿体和细胞核混合物）；6.将沉淀用2-3ml0.35mol/L氯化钠液悬浮；7.取一滴悬液滴片，加盖片后显微镜下观察。8.另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，混匀，盖上盖片后，在荧光显微镜下观察。【实验结果】普通光学显微镜下对叶绿体的观察图表1普通光学显微镜下菠菜叶的叶绿体（10*40）普通光学显微镜下可看到：菠菜叶绿体呈绿色的橄榄形因为离心不当，带有一定量的杂质山东大学实验报告2014/11/18姓名：XXX系年级：20XX级齐鲁医学班学号：201XXXXXXX科目:细胞生物学实验实验题目:叶绿体的分离及荧光观察图表2普通光学显微镜下叶绿体局部放大图（10*40）仔细观察可看到基粒——深绿色的小颗粒山东大学实验报告2014/11/18姓名：XXX系年级：20XX级齐鲁医学班学号：201XXXXXXX科目:细胞生物学实验实验题目:叶绿体的分离及荧光观察荧光显微镜下的叶绿体图表3荧光显微镜下未被染色的叶绿体（10*40）荧光显微镜下可观察到：未被染色的叶绿体自发荧光为火红色，呈点状分布，其他部分为黑色。山东大学实验报告2014/11/18姓名：XXX系年级：20XX级齐鲁医学班学号：201XXXXXXX科目:细胞生物学实验实验题目:叶绿体的分离及荧光观察图表4荧光显微镜下已被染色的叶绿体（10*40）吖啶橙染色后荧光显微镜下，对叶绿体的观察：叶绿体可发出桔红色荧光。其中混有的细胞核则发绿色荧光其他大部分，背景为绿色。【实验结果分析】1.普通光学显微镜下观察到的叶绿体呈绿色橄榄形，高倍镜下仔细观察可看到叶绿体内部含有深绿色的小颗粒——基粒。另外还可以观察到形状较小且不规则的组织碎片，这是因为在离心过程中，因为离心不彻底造成叶绿体沉降物中含有其他组织碎片。2.荧光显微镜下，叶绿体自发荧光为“火红色”，次生荧光为“桔红色”。3.未染色的玻片在荧光显微镜下观察，叶绿体为“火红色”，呈点状分布，且背景为黑色。这是因为叶绿体自身在悬液中呈点状分布，并且其中的叶绿素在经过激发光波照射后，可放出火红色的自发荧光，并且悬液中的其他成份不发生荧光反应4.染色后的玻片在荧光显微镜下观察，叶绿体为“桔红色”，其中混有的细胞核碎片中含有的核酸在吖啶橙的作用下呈绿色。背景空白处为绿色，这是因为载玻片有杂质。【实验注意事项】山东大学实验报告2014/11/18姓名：XXX系年级：20XX级齐鲁医学班学号：201XXXXXXX科目:细胞生物学实验实验题目:叶绿体的分离及荧光观察1.荧光显微镜有两套光源系统，先在自然光源下调整好观察视野，再切换到荧光光源观察。2.要注意正确的使用荧光显微镜：（1）不要直接观察激发光源，保护眼睛（2）荧光染料有一定毒性，要做好防护（3）观察荧光受多种因素的影响，如温度、光、淬灭剂等（4）在荧光观察时应抓紧时间，立即拍照，防止荧光会发生淬灭，造成整体发红。（5）荧光显微镜不能随意开关，汞灯开启15分钟之内不能关闭。3.叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNaCl）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受损伤；4.制作装片，滴加悬液时，先用吸管吹匀悬液，滴加时，不能滴加太多，若滴加过多的话，则用滤纸片吸取多余液体，否则，观察目标在镜头下漂浮，不方便观察。5.吖啶橙可染细胞核，对人体危害比较大，不能用手直接接触。6.离心管必须等量，对称地放入离心机中；7.分离结束后，先关闭离心机，在离心机彻底停止转动后，才可打开离心机，取出试样。8.差速离心法不能得到完全纯净的叶绿体，要想获得更纯的叶绿体，可以用密度梯度离心法。9.制片时注意所取的悬液尽量适量，保证视野中的叶绿体的数量。【实验反思】1.叶绿体的稀释倍数要恰当，数量太少在荧光显微镜下难以观察到。我们组一开始制作的玻片中因为叶绿体数量太少，在荧光显微镜下几乎观察不到叶绿体的存在；2.通过这次试验，我较为清楚的知道了荧光的相关概念和荧光显微镜的使用方法及相关注意事项，知道了以后进入实验室，必须具备丰厚的知识和熟练的操作技能，这样才能将实验做成功。