基因工程参考答案

1名词解释基因工程：用人工方法,在体外对DNA分子进行切割、连接，组成重组DNA分子，再导入生物体内,并使其在异种生物内复制、表达,从而使受体生物获得新的遗传性状,这一全过程称为基因工程。（PPT）限制酶：限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。（P21页）DNA连接酶：DNA连接酶是一种能够将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。（或DNA连接酶是一种能够催化双链DNA片段紧靠在一起的3`羟基末端与5`磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来的酶）（P27页）DNA聚合酶：DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶。（P30页）DNA修饰酶：DNA修饰酶是一类通过添加或删除化学基团来修饰DNA分子的酶，主要有末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）、碱性磷酸酶、T4噬菌体多核苷酸激酶等。（P22页与网上整理结合）质粒：质粒是一些存在于微生物细胞染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，是能够进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。（P42页）穿梭质粒：穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制，并可以携带着外源DNA在不同物种的细胞之间往返穿梭的质粒载体。（P56页）：噬菌粒：噬菌粒是一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列。（P77页）粘粒载体：粘粒又称柯斯质粒，是一类由人工构建的含有λDNA粘性末端cos序列和质粒复制子的杂种质粒载体。（P70页）M13噬菌体载体：M13噬菌体是一种含有6.4kb环状单链DNA分子的大肠杆菌丝状噬菌体。（73页及PPT）克隆载体：克隆载体是指具有在细胞内进行自我复制能力的DNA分子，是外源基因的运载体，又称无性繁殖载体。末端脱氧核苷酸转移酶：末端脱氧核苷酸转移酶是一种来源于小牛胸腺，为核酸末端加上一个同聚物尾巴的DNA修饰酶。T4噬菌体多核苷酸激酶：T4多聚核苷酸激酶（T4polynucleotidekinase）酶是由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质。该酶催化r(是拉丁文不是字母)-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA分子的5’-OH末端,生成5’－P。碱性磷酸酶：碱性磷酸酶有两种不同来源，一种是从大肠杆菌中纯化出来的细菌碱性磷酸酶，另一种是从小牛肠中纯化出来的小牛肠碱性磷酸酶。它们的共同特性是能够催化核酸分子脱掉5’磷酸基团,从而使DNA（或RNA）的5’-P末端转化为5’-OH末端。（P36）定向克隆：当用两种不同的限制酶消化外源DNA时，可以产生非互补突出末端的外缘DNA片段，此种片段可采用定向克隆法，即只以一个方向很容易地将其插入到同样用这两种限制酶进行消化而产生相匹配粘端的载体当中。（P104）DNA体外重组：DNA体外重组是将目的基因用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上，这种重新组合的DNA称为重组DNA。（P101）转化：将带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程。转染：将带有目的基因的重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程。转导：将带有目的基因的重组噬菌体DNA包装到噬菌体头部成为有感染力的颗粒，再导入受体细胞中的过程。电穿孔转化法：将宿主细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，瞬时提高细胞膜的通透性周围基质中的DNA可渗进细胞化学转化法：化学药物如氯化钙等的转化氯化钙法转化细胞：细菌处于0℃及CaCl2低渗溶液中时，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理促进细胞吸收DNA复合物。适用于大部分大肠杆菌菌株，并具有简单快速、重复性好的优点。感受态细胞：受体细胞经过电穿孔、CaCl2、RbCl(KCl,铷)等处理后，细胞膜的通透性暂时改变，允许外源DNA分子进入。2放射性探针：是指一段带有放射性同位素标记的、与目的DNA或RNA片段的序列互补的单链核苷酸，将它与一个DNA片段进行杂交可检测该片段中是否含有目的序列（放射自显影技术）。抗生素抗性基因插入失活法：许多质粒载体都含有抗生素抗性基因，这些基因内有某些酶的识别位点。当用某种限制酶消化并插入外源目的基因时，抗药性基因将不被表达，从而在药物筛选平板上培养时，可区分出重组转化子的菌株的方法。β-半乳糖苷酶插入失活法：许多载体带有来自大肠杆菌Lac操纵子DNA区段（含β-半乳糖苷酶的头146个编码信息和调控序列，还插入了一个多克隆位点）。而宿主细胞可编码β-半乳糖苷酶C端，两者之间可以实现基因内的互补，成为具有酶学活性的蛋白质。Lac+细菌在有诱导物，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落。当多克隆位点上插入了外源基因时，LacZ的N端片段失活。因此带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。基因产物鉴定法：通过鉴定产物从而确定所克隆的DNA片段或分离的mRNA是否是目的片段或其mRNA。复制子：DNA复制从起始点开始直到终点为止，每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。启动子：是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列，是基因表达调控的重要元件。终止子：是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列。转录启动后，RNA酶沿着DNA链移动，持续合成RNA链，直到遇到终止信号为止。起始密码：也称翻译起始密码子，是翻译的起始位点,通常为AUG（ATG）,是首选的起始密码子，编码甲硫氨酸，也有极少数生物利用其他密码子作为翻译的起始位点。终止密码：即翻译终止密码子，翻译过程中，当核糖体移动遇到终止密码子，核糖体就从mRNA上模板上脱落，终止蛋白质的翻译过程。密码偏好性：编码氨基酸的密码子具有简并性，而每种生物对同义密码子的选择都有自己的偏好性。SD序列：核糖体结合位点，指原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列，即SD序列。基因定点诱变法：是在体外特异性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一个特定碱基的技术,包括盒式取代诱变、寡核苷酸引物诱变及PCR定点诱变等。电镜R-环检测法：是一种采用mRNA作探针，用于检测具有外源DNA插入片段重组体分子的核酸杂交法。其原理是：在临近双链DNA变性温度下和高浓度（70%）的甲酰胺溶液中，双链的DNA-RNA杂交分子要比双链的DNA-DNA分子更稳定。SOUTHERNBLOT：一种可以用来确定克隆的特定DNA序列，判明插入片段来自染色体基因组的哪一部位，还可以证明是否带有目的基因片段的方法。1.基因工程操作步骤（1）获取外源目的基因.（2）外源目的基因的加工.（3）基因运载体的分离提纯.（4）重组DNA分子的形成.（5）重组DNA转入受体细胞．（6）重组菌的筛选、鉴定和分析．（7）工程菌的获得和基因产物的分离.2.如何将基因信息转化成基因实物?3.PCR扩增目的基因的原理及步骤原理：由于DNA在高温下会裂解为两条链，当温度下降后能够复性成为双链，所以可以通过控制温度的变化，设计引物作为启动子，加入dNTP和taqDNA聚合酶，可以实现PCR体外扩增。步骤：1、变性，温度升高至94oC，DNA双链裂解为单链；2、退火(复性）温度下降至40-60oC，使之与引物结合；3、延伸，在72oC下，以dNTP为原料，按半保留复制和碱基互补配对原则合成新链。4、重复1-3.4.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的功能，Klenow如何获得,有那些特性及用途?功能：○15’至3’聚合酶活性○25’至3’核酸外切酶活性○33’至5’核酸外切酶活性获得：Klenow是枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶1而产生出来的大片段分子，或者通过克隆技术而得到的单一多肽链，由全酶中去除了5‘至3‘核酸外切酶活性。3特性：去除了5‘至3‘核酸外切酶活性,而5’至3’聚合酶活性和3’至5’核酸外切酶活性均不受影响。用途：1、补平限制酶切割DNA后产生的3‘凹端；2、用[32P]dNTPPT对DNA片段的3‘凹端进行末端标记；3、在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；4、应用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序。5.理想质粒的特点？质粒的基本构成(有哪几部分)pBR322的构成部件？为什么相同复制子的不同载体不能在同一宿主中共存？理想质粒的特点：1)具有复制起点（必不可少的基本条件）即具有复制子(Replicon)功能,且复制起始区中没有所需限制酶切位点2)具有两种易被检测的选择性标记理想的质粒克隆载体应具有两种抗菌素抗性基因，在插入外源DNA片断之后所形成的重组质粒中,至少保留一个强选择标记3)具有多种限制酶的单一识别位点具有多种限制酶单一切点,适用于各种限制酶产生的DNA片断的插入,满足克隆需要.4)具有尽可能小的相对分子量分子量小有利于分离纯化,有利于克隆较长DNA片断,有利于质粒DNA的制备以及使克隆基因的剂量增加,使限制酶的多重识别位点的机率降低.5)应该属于松弛复制型松弛复制型的质粒载体DNA在氯霉素存在下大量扩增其拷贝数,使细胞中克隆基因的剂量增加6)应为非传递性质粒。从生物的安全防护考虑。质粒的组成：必要区：在必要区中与质粒DNA复制有关的基因，他们对质粒的存活及复制功能都极为重要非必要区：在非必要区中，有直接影响细胞表现，如结合转移，对毒物的抗性等形状的基因存在。pBR322质粒是由3个不同来源的部分组成。1、pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（Ampr）2、pSC101质粒的四环素抗性基因（Tetr）3、ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）相同复制子的不同载体在细胞内复制时会相互竞争，由于大小不同，复制所需时间不同。较小的载体所需时间短，经过一段时间的复制后其数量会远超过较大载体，从而将较大载体淘汰掉。所以相同复制子的不同载体不能共存于同一宿主。6.穿梭质粒必备的功能元件。以穿梭质粒为代表介绍：基因组成元件1)DNA复制启始序列，含大肠杆菌和酵母中复制的两套复制子。2)选择标记，分为缺陷型(与宿主基因有关，载体可弥补之，β-半乳糖苷酶)和显性两类(增加其性状，如抗生素抗性，常用)。3)启动子---大小约1~2kb，一般活性低，故需强启动子，以及增强子。4)分泌信号序列---提高蛋白的分泌?正常不能分泌.5)终止子---终止转录有丝分裂稳定区---保证能够平均分配到子代细胞7.质粒、噬菌体、黏粒载体的运载DNA能力有多大?原因是？质粒：大小4KB,一般复制能力10KB,所以运载能力小于10KB,一般在5KB左右噬菌体：其头部蛋白质外壳对所包装DNA大小有严格要求，只有75-105%的野生型λDNA长度(38-52kbDNA)才能被包装成噬菌体颗粒。故插入型10KB左右,取代型10-20KB,因为噬菌体一般为48KB粘粒载体(柯斯质粒)：35-45KB,,大到47KB,小到31KB48.放射性标记探针的各种制备方法（1）切口平移法1.加入微量的DNaseⅠ造成断裂，产生缺口2.DNA多聚酶Ⅰ附着在切口上，由于该酶的5′→3′外切酶活性，它可以从切口开始沿5′→3′方向逐个地切除脱氧核苷酸。3.DNA多聚酶Ⅰ附着在切口上，由于该酶的5′→3′外切酶活性，它可以从切口开始沿5′→3′方向逐个地切除脱氧核苷酸。4.切口就不断向右移动，同时切口左侧的新合成的DNA链不断延长。5.如果加入反应系统的四种dNTP中有任何一种或两种是用3H或32P标记，那么由于切口平移而新合成的DNA链便具有放射性了，而且其碱基序列仍与反应前的DNA分子完全一样，这样就可以用作杂交探针。（2）引物延伸法DNA聚合酶可利用寡核苷酸作引物，沿单链模板起始DNA的合成。随机引物可从一些厂家购买，也可在自动DNA合成仪上合成一个八聚体分子集群作为引物。使用一种［32P］dNTP和3种未标记的dNTP为前体，可合成高比活度的标记DNA探针。5（3）体外转录合成以DNA为模板在体外制备单链探针主要有两种方法，1）一种是合成可与克隆于M13噬