壮筋续骨汤对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶比活性骨钙素含量和Cbfal基因表达影响的研究

壮筋续骨汤对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶比活性、骨钙素含量和Cbfαl基因表达影响的研究王力郑甦杨凤云邓运明王丽华熊兴勇(江西中医学院附属医院关节骨科，江西南昌330006)摘要：目的探讨壮骨续筋汤对大鼠成骨细胞功能态的影响方法采用含药血清的方法体外培养成骨细胞，分壮骨续筋汤组、对照组，观察各组碱性磷酸酶比活性、骨钙素含量及Cbfαl基因的表达；结果壮骨续筋汤组的碱性磷酸酶比活性、骨钙素含量及Cbfαl基因的表达强于对照组（P＜0.05）。结论壮骨续筋汤能促进成骨细胞功能态的发挥。关键词：壮骨续筋汤成骨细胞碱性磷酸酶比活性骨钙素Cbfαl基因【Abstract】Objective:TostudytheeffectofZhuangguXutongrecipetothefunctionoftheSDrats，osteoblast.Methods:Accordingtothedrugcontainingserummethods,theosteoblastofSDratswerecultured.Theyweredividedrandomlyintotwogroups:ZhuangguXutongrecipegroupandcomparisongroup,thespecificactivityofalkalinityphosphatase(ALP),thecontentsofboneglacontainingprotein(BGP)andtheexpressionofcorebindingfactorα1wereobservedineachgroup;Results:thespecificactivityofALP,thecontentsofboneglacontainingprotein(BGP)andtheexpressionofcorebindingfactorα1ofZhuangguXutongrecipegroupwerehigherthancomparisongroup（P＜0.05）.Conclusion:ZhuangguXutongcanincreasethefunctionoftheSDrats，osteoblast.Keywords:ZhuangguXutongrecipeOsteoblastSpecificactivityofalkalinityphosphataseBoneglacontainingproteinCorebindingfactorα1体外培养细胞，有两种基本状态：即增殖态和功能态。功能态为细胞进行特定功能活动如分泌、传导、吞噬、收缩等的时期，是细胞的第二种生存状态。本研究以中药壮筋续骨汤作为研究对象，采用中药血清药理学的方法体外培养成骨细胞，观察其对碱性磷酸酶比活性、骨钙素含量及Cbfal基因的表达等功能态的影响。1实验材料1.1仪器与试剂倒置相差显微镜（日本OLYMPUS）、CO2培养箱（德国Heraeus）;DU650紫外分光光度计(美国BECKMAN)；α－MEM(HyClone)、新生牛血清（NCS,HyClone）、青－链霉素溶液(HyClone)、HEPES(上海生工)、胰蛋白酶（1：250,AMRESCO）、β－甘油磷酸_______________________________________________________________________________基金项目：江西省自然科学基金课题（课题编号：0640170）钠（β－GP,Sigma）、地塞米松(Sigma)、VitC(上海化学试剂公司)、碱性磷酸酶（ALP）和总蛋白试剂盒（南京建成生物工程研究所）、骨钙素(BGP)放免试剂盒（中国原子能科学研究所）、DU650紫外分光光度计(美国BECKMAN)；9600基因扩增仪(美国PE生物系统公司);GELDOC2000凝胶成像系统(美国BIORAD)；MILLI-QBiocel超纯水装置(美国MILLIPORE)；64R低温高速离心机(美国BECKMAN)；TRIZOL试剂（华美）；Taq酶（上海生工）；反转录酶（上海生工）；引物（上海生工合成）等。1.2壮筋续骨汤的制备当归10g、菟丝子20g、西党20g、补骨脂20g、刘寄奴20g、川芎10g、白芍10g、杜仲10g、桂枝10g、三七10g、煅狗骨10g、木瓜310g、熟地40g、川断15g、五加皮15g、骨碎补30g、黄芪30g、蛰虫10g,上药加双蒸水8倍，浸泡2小时，煮沸1小时，收集药液，再加双蒸水6倍，煮沸1h，收集药液，再加双蒸水，煮沸1小时，合并三次药液，以3000r／min离心30min，取上清，4℃冰箱保存。1．3实验动物的购买及饲养SD大鼠60只（清洁级30天龄），雌雄各半，每只体重280±20g，购自浙江省实验动物中心。动物进入动物实验中心后适应性饲养三天，给予普通饲料饲养、自由活动、自由饮水、通风、光照充足、温度在21℃，相对湿度控制在70～80%，动物的饲养在江西中医学院动物实验中心进行。2实验方法2．1动物的分组：按实验要求对实验动物进行随机分组，共分成2组：壮筋续骨汤组(A组)30只、对照组(B组)30只。2．2动物灌胃：灌胃时分别制成1g/ml生药的混悬液200ml，，一日剂量分2次灌胃，每次灌1g/ml生药0.25ml/100g，第4天1次灌胃全天剂量，采血前禁食12小时，末次给药1小时后采血。对照组的大鼠给予等量生理盐水灌胃。2．3含壮筋续骨汤血清的制备：各组灌胃后，氯胺酮0.5ml/100g＋安定0.5ml/100g腹腔注射，待麻药起效后腹主动脉取血，取血后静置1h后，以3000r／min离心15min，分离血清，取上清液，再经0.22μm的针头滤器过滤除菌，56℃水浴，30分钟灭活，-20℃冰箱保存备用，血清制备完成。2．4成骨细胞的分离与培养；取1～2日龄的SD大鼠乳鼠的颅盖骨，以胰酶-胶原酶消化法分离获得成骨细胞。具体方法为：⑴取新生SD乳鼠1～2天龄2只，75%的酒精中浸泡3～5分钟并且用薄膜封闭；⑵揭去头顶皮肤，剪下头盖骨，并且将头盖骨置入PBS溶液中；⑶清除骨膜、血管等软组织，再用PBS液清洗3次后将洗净的头盖骨剪成1mm×1mm的小片；⑷将小骨片移入0.25%胰蛋白酶（3～5ml）以覆盖为度，37℃预消化20分钟；⑸再将组织块移入0.1%Ⅱ型胶原酶溶液（3～5ml）中37℃振荡（60次/分）90分钟；⑹将0.1%Ⅱ型胶原酶消化过的组织液即细胞悬液在1000r/min的离心机上离心10分钟后吸取上清液；⑺将沉淀的细胞团块加入培养液（培养液为含10%的NCS、10mmol/Lhepes液1ml、100μ/ml青霉素-链霉素1ml的α-MEM，并且用7.4%的NaHCO3调节PH值在7.2～7.4范围）吹打并且加至10ml；⑻细胞计数后分装25ml的培养瓶中置于倒置显微镜下观察后放入CO2培养箱37℃培养24小时后贴壁2～3天换液一次等到汇合长满培养瓶时就开始传代即原代培养结束。2.5碱性磷酸酶比活性的测定：每组各设3孔，各组分别诱导至第1、3、6、9、12天进行碱性磷酸酶比活性的测定，测定时取培养液，分别按碱性磷酸酶和总蛋白试剂盒说明书进行操作，碱性磷酸酶比活性计算：碱性磷酸酶比活性（U/mg）=碱性磷酸酶活性（U/L）÷蛋白浓度（mg/L）。2.6骨钙素含量测定：每组各设3孔，各组分别诱导至第6、12、18、24天分别取培养液进行骨钙素含量的测定，按骨钙素放免试剂盒说明书进行操作。2.7运用RT-PCR法观察壮筋续骨汤对成骨细胞分化过程CbfαlmRNA的表达的影响：分别在3、6、9、12、18天采用RT-PCR法检测Cbfα1mRNA的表达（每天共三瓶），并与对照组对照；(1)总RNA的提取:在各培养瓶中分别加入TRIZOL1ml，按试剂说明书提取，最后加适量无RNA酶的超纯水溶解，稀释60倍以紫外分光光度计测A260，A280的值，计算出浓度及纯度；(2)反转录取1ug总RNA，oligo(dT)180.5ug，加DEPC处理去离子水至11ul，70℃5min后依次加5×buffer4ul，10mMdNTPmix2ul，rRNasin20U，加DEPC处理去离子水至19ul，37℃5min，取出加反转录酶（M-MuLV）200U后42℃60min，70℃10min结束反应；(3)PCR反应体系：DEPC处理去离子水18.3ul，10×buffer2.5ul，10mMdNTPmix0.5ul，25pmolβ-actin上下引物各0.2ul，Cbfα1上下引物各0.4ul，2.5U/ulTaq酶0.5ul。总反应体系25ul。反应温度，94℃4min后进入循环，94℃30s,62℃30s,72℃30s，35个循环，72℃10min。引物：Cbfα1sense5’-GAGGGCCACAAGTTCTATCTGGA-3’;Cbfα1antisense5’-GGTGGTCCGCGATGATCTC-3’,β-actinsense5’-CCCATTGAACACGGCATT-3’,β-actinantisense5’-GGTACGACCAGAGGCATACA-3’。产物放在1.5％凝胶上电泳，凝胶用GELDOC2000凝胶成像系统扫描分析，计算Cbfα1表达量与β-actin表达量的比值。3．统计方法：采用单因素方差分析，所有数据分析均在SPSS12.0软件上进行，以ａ=0.05为显著性差异。4.实验结果4.1碱性磷酸酶比活性测定结果（U/mg，_x±S）：组别时间（天）136912A组1.2100±0.2867*2.1331±0.2583*2.0856±0.0355*1.5081±0.3293*1.1323±0.0861*B组1.0535±0.01671.4053±0.09801.1705±0.01971.2587±0.10511.0816±0.0445*表示使用SPSS12.0软件分析在同一时间点与B组比较P＜0.05，有显著性差异.4.2骨钙素(BGP)含量测定（ng/ml，_x±S）组别时间（天）6121824A组0.1464±0.0047*0.3417±0.0015*0.5056±0.0511*1.1813±0.1129*B组0.0840±0.00370.1436±0.01000.2236±0.01460.6005±0.1210*表示使用SPSS12.0软件分析在同一时间点与B组比较P＜0.05，有显著性差异.4.3各组cbfα1基因的相对表达量（n=10,_x±S）组别时间（天）3691218A组0.5331±0.12310.6920±0.13520.9351±0.1457*1.6360±0.1572*1.7552±0.1230*B组0.5350±0.12410.7952±0.12131.1362±0.21811.3522±0.12521.3274±0.1100*与相应对照组比较，P0.054讨论骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。中药血清药理学最初由日本学者田代真一在1985年提出[1]，它是指将中药或中药复方经口灌服动物一定时间后采取血液、分离血清，用此含有药物成分的血清进行体外实验的一种方法学。中药血清药理学提供了利用现代化手段来研究中医药，从细胞、分子、基因水平研究中药的作用与其机理的方法，并有助于中药化学成分研究及中药药动学研究的深入，为中药与西药的研究在实验方法上找到了结合点。它既具有体外实验条件可控性强、药物效应易于检测，便于从细胞生物学和分子生物学来角度入手则可深入揭示药物作用机理，又能够防止中药组制剂本身的理化性质对实验的干扰，还能反映中药在胃肠道消化吸收，再经生物转化，最后产生药理效应的真实过程，其原有