响应曲面法优化五倍子生料发酵产单宁酶的条件

响应曲面法优化五倍子生料发酵产单宁酶的条件摘要：单因素实验表明五倍子含量、初始加水量、培养温度是显著影响黑曲霉B0201利用五倍子生料固体发酵产单宁酶的因子。在此基础上采用中心旋转组合设计，建立了五倍子生料发酵产单宁酶的二次多项数学模型，探讨了主要因素的影响效应及其交互作用，优化出最佳条件为：五倍子含量17%、液固比为1.5∶1、温度32℃，并验证了模型的有效性，从而表明响应曲面优化的模型适合于五倍子生料发酵工艺。关键词：响应曲面；中心旋转组合设计；单宁酶；五倍子；生料发酵OptimizationofconditionsoftannaseproductionwithGallnutbyunsterilefermentationusingresponsesurfacemethodologyAbstract:TheresultsoffactorialexperimentshowedthatthecontentofGallnut,initialmoistureandincubationtemperaturewerethesignificantfactorsthatseverelyaffectedAspergillusNigerB0201producingtannasewithunsteriledGallnutbysolid-statefermentation.Basedontheresults,centralcompositerotatabledesign(CCRD)wasemployed.AsecondorderquadraticequationforunsterilefermentationofGallnutwasbuiltandeffectofmainfactorsandtheircorrespondingrelationshipswerestudiedinthepresentwork．Theoptimalconditionswere17%Gallnutcontent,1∶1.5oftheliquid-solidratio,32℃intemperature.Theapplicabilityofthemodelequationforpredictingtheoptimumresponsevalueswasverifiedeffectivelybythevalidationdata,thusindicatingthesuitabilityofresponsesurfacemethodology(RSM)inoptimizingtheprocessofunsterilefermen-tationofGallnutwerewell.Keywords:responsesurfacemethodology(RSM);centralcompositerotatabledesign(CCRD);tannase;Gallnut;unsterilefermentation单宁酶可水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖[1]。单宁酶广泛地应用响应曲面法优化五倍子生料发酵产单宁酶的条件于饮料、酿酒、医药、制革、化妆品等领域，特别是在制备药用中间体没食子酸和食品抗氧化剂没食子酸丙酯(PG)，以及在处理茶叶的“冷后浑”和啤酒沉淀等方面，有重要应用价值。美国食品与药物管理局(FDA)已确定单宁酶为安全产品，在日本单宁酶也通过批准应用于食品工业[2，3]。但目前生产单宁酶的效率不高，市场价格昂贵，阻碍了单宁酶的应用，因此单宁酶发酵生产的研究具有重要的意义。本课题组发现了一种实用性很强的生产单宁酶的新方法，即黑曲霉B-0201利用五倍子生料固体发酵生产单宁酶。此生料发酵工艺非常适合利用五倍子为诱导物生产单宁酶，避免了高温对五倍子的破环，简化了设备和生产流程，节约了成本，且大幅度地提高了单宁酶的生产效率，单宁酶活力是常规灭菌工艺的3.6倍。本文在单因子实验研究的基础上，采用De－sign-Expert7.0中CentralCompositeRotatableDe－sign(CCRD)即中心旋转组合设计原理[4]，对影响黑曲霉利用五倍子生料固体发酵产单宁酶的显著因子—五倍子的含量、初始加水量和培养温度进行了进一步的探索，建立了五倍子生料发酵新工艺的二次多项数学模型，获得生产单宁酶的最佳工艺条件，为五倍子生料发酵工艺在生产单宁酶中的应用提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种黑曲霉B-0201(Aspergillusniger)：由贵州省发酵工程与生物制药重点实验室紫外诱变原始黑曲霉菌株筛选出来，菌种在4℃条件下保存在马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上。1.1.2固体发酵培养基称取五倍子粉1g、麸皮4g装入250mL的三角瓶作为培养基基础，加入1%(w/w)(NH4)2SO4、0.1%(w/w)MgSO4·7H2O、0.1%(w/w)NaCl、8mL蒸馏水，调节初始pH为6.0，搅拌均匀。1.1.3主要仪器与设备UV2550紫外可见分光光度计，恒温培养箱。1.1.4主要试剂没食子酸丙酯：湖南省张家界贸源化工有限公司；绕单宁：上海君创化工有限公司；五倍子：贵州省遵义市余庆县；试剂均为化学纯。1.2实验方法1.2.1培养条件五倍子生料发酵：发酵培养基配好后，不经高压蒸气灭菌，直接接种1mL黑曲霉孢子悬液(1×108个孢子)，混匀后置于30℃培养箱中静置培养96h。1.2.2粗酶液提取取出250mL的三角瓶，在三角瓶中加入100mLpH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，30℃条件下150r/min振荡浸提1h，用定性滤纸过滤即得粗酶液。1.2.3酶活检测方法根据文献[7]测定单宁酶活力的方法测定。单宁酶在pH5.0、30℃条件下每分钟产生1μmol没食子酸所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。1.3实验设计影响黑曲霉利用五倍子生料固体发酵产单宁酶的主要因素为五倍子的含量、加水量、温度、接种量、装量、初始pH、碳氮源、磷酸盐和培养时间。用SPSS16.0forWindows对单因素实验数据进行方差分析[5]，将影响较小的因素和定性因素取为常量，选出显著影响的变量因素为五倍子含量、初始加水量和培养温度。优化实验设计采用响应曲面法(RSM)，所用软件为Design-Expert7.0，实施模型为中心旋转组合设计(CentralCompositeRotatableDesign，CCRD)。选取五倍子含量：初始加水量和培养温度3个因素，采用3因素3水平的响应面分析方法，根据单因素结果选取因素水平。实验因素与水平设计见表1。对五倍子含量：初始加水量和培养温度作如下换算：X1=五倍子含量，X2=液固比，X3=培养温度。按方程xi=(Xi-X0)/X对自变量进行编码，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值。X0为实验中心点处自变量的真实值，X为自变量的变化步长，其中alpha=1.68179。2响应面优化结果与分析2.1回归模型的建立及显著性检验采用多元回归技术，拟合二次多项模型的表1响应面设计因素水平表编码水平(xi)-alpha11.5911.2636421.591-1151.4250201.6301251.835alpha28.4091.9363638.40因素X1五倍子含量/%X2液固比X3温度/℃生物工程·10·FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY食品科技2009年第34卷第7期CCRD设计与结果见表2。以3次实验所得单宁酶酶活力的平均值为响应值(Y)。采用Design-Expert7.0程序对表2响应值与各因素进行回归拟合后，得到单宁酶活力对五倍子含量(x1)、初始加水量(x2)和培养温度(x3)编码值的二次多项回归方程为：Y=53.56-3.71x1-2.99x2+9.85x3+0.88x1x2－0.72x1x3+2.30x2x3－3.89x21－1.66x22－13.75x23。对该模型进行方差分析，结果见表3，回归方程系数显著性检验结果见表4。回归方程中各变量对指标(响应值)影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高。由表3可以看出，模型P0.0001，表明回归模型极显著，失拟项P=0.15920.05，模型失拟度不显著，其校正决定系数RAdj2=0.9552，表明仅有总变异的4.5%不能由该模型进行解释。相关系数R2=0.9764，表明该模型拟合程度良好，实验误差小，该模型是适合的，回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该模型可以确定最佳发酵培养基及发酵条件。AdeqPreci－Sion值为23.921，远大于4，说明模型完全可以用来对实验结果进行拟合。从表4中可以看出，在本实验的水平范围内显著的因素为一次项X1、X2、X3，二次项X21，X23，交互相不显著。对编码值的回归方程取一阶偏导数，整理可得到如下三式：-3.71+0.88x2－0.72x3－7.78x1=0(1)-2.99+0.88x1+2.30x3－3.32x2=0(2)9.85－0.72x1+2.30x2－27.5x3=0(3)式(1)、式(2)、式(3)联立方程组，解得x1=-0.589、x2=-0.85、x3=0.3，换算成真实值X1＝17.01，X2＝1.43、X3＝31.5。综合考虑实际操作的便利，将黑曲霉固体发酵最佳产酶条件修正为：五倍子含量为17%、液固比为1.5∶1、温度为32℃。在此条件下进行发酵产酶，由回归方程预测酶活力为57.18U/gds。2.2五倍子生料发酵工艺的响应面分析及优化通过模型方程所作的三维响应面图及与之对应的等高线图1~图3能比较直观地解释各变量和变量之间对响应值的影响[6]。利用该图可以将其3个变量中的1个变量固定在中心水平值，而对另外2个变量交互影响单宁酶的产生进行分析与评价。等高线的形状可以反映出交互作用的强弱，表2响应面实验设计与结果实验号因素Y酶活/(U/gds)x1x2x3实验值预测值11-1140.8939.492alpha0038.0136.32300-alpha2.28-1.904-11-118.4621.23500056.453.566-11146.446.97700alpha28.9731.23800052.4353.56900051.953.5610-1-1154.9750.111111139.239.8712-alpha0049.0348.80131-1-125.0325.8314-1-1-132.8933.571500055.653.561611-113.1417.01170-alpha051.853.891800052.653.561900050.053.56200alpha047.8343.83表3回归模型方差分析表方差来源自由度平方和均方F值P值显著性模型94504.94500.5546.020.0001高度显著残差10108.7610.88失拟项578.5215.702.600.1592不显著纯误差530.246.05总和194613.70注：R2=0.9764，RAdj2=0.9552，RPred2=0.8612，AdeqPrecision=23.921。表4回归方程系数显著性检验表系数项系数估计值自由度标准误差F值P值显著性常数项53.5611.35x1-3.7110.8917.250.0020++x2-2.9910.8911.250.0073++x39.8510.89121.710.0001++x1x20.8811.170.570.4672x1x3-0.7211.170.380.5527x2x32.3011.173.900.0764x21-3.8910.8720.050.0012++x22-1.6610.873.670.0844x23-13.7510.87250.590.0001++注：+为显著(P0.05)，++为高度显著(P0.01)。生物工程·11·FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY食品科技200