单分子动态调控

对蛋白质单分子动态调控、构象、分子互作的个人理解蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。蛋白质分子是生命活动的主要承担者。所有的遗传信息DNA，RNA所蕴含的遗传信息按照中心法则进行传递，但最终结构和功能的体现都要靠蛋白质分子来实现。如：构成生物体，如结构蛋白运输作用，如血红蛋白催化作用，如酶调节作用，如胰岛素免疫作用，如抗体运动作用，如肌纤维中的肌球蛋白和肌动蛋白控制作用，如阻遏蛋白蛋白质具有一级、二级、三级、四级结构，蛋白质分子的结构决定了它的功能。在正常的生命活动中，各种蛋白质分子的存在是为了维持机体正常的代谢。这些正常的生理过程需要多种不同功能的蛋白分子相互配合来实现。其中就涉及蛋白质分子的空间结构，构象的改变，蛋白质分子间的相互作用。所有的这些都是为了发挥正常功能服务的。在生物进化的漫长过程中，机体不断改进，将最适合自身生存的代谢过程留存下来。机体正常生活的进行需要这些生理过程时刻高效运行。以下是一些实例：一．胰高血糖素和胰岛素相互配合来调控血糖的平衡。二．在免疫过程中。TCR（T细胞受体）激活过程中涉及到磷酸化和去磷酸化。这就需要蛋白激酶（Csk，LCK磷酸化作用）和磷酸酯酶（CD45，CD148去磷酸化作用）。根据机体的需要二者保持动态平衡使免疫反应顺利进行。三．TCR-CD3复合体的组装需要多个蛋白分子参与。TCR对外源和内源peptide-MHC进行识别时，也需要蛋白分子间的协同作用来实现高效的识别能力。四．“PlantCell.2011Single-moleculeanalysisofPIP2;1dynamicsandpartitioningrevealsmultiplemodesofArabidopsisplasmamembraneaquaporinregulation”中报道：中科院植物研究所林金星研究组及其合作者应用隐失波显微镜（EWM）和荧光相关光谱技术（FCS），结合单颗粒追踪分析技术，在单分子水平上对拟南芥幼苗根表皮细胞质膜水通道蛋白（PIP2;1）进行了活体动态分析。研究发现，（1）PIP2;1在细胞质膜上存在多种运动模式，而且扩散系数分布范围较广，证实PIP2;1在细胞质膜上的运动和分布具有非均一性的特点。（2）该蛋白可以在毫秒内通过侧向运动进入特定的质膜微区，在微区内实现快速的活性调控。（3）通过单分子共定位和荧光交叉相关光谱分析发现，在正常条件下，PIP2;1主要通过对酪氨酸磷酸化抑制剂（tyrphostinA23）敏感的笼形蛋白（clathrin）依赖途径进行内吞；在高渗胁迫时，PIP2;1内吞加剧，脂筏（membraneraft）介导的内吞途径被激活，协同参与PIP2;1的内吞。该项工作首次在植物活细胞中，实现了在单分子水平上分析单个蛋白的分布、聚合状态、内吞过程及其调控之间的联系，揭示了不同内吞途径参与多元调控PIP2;1蛋白活性的新机制。五．当癌细胞快速增生时，它们需要一种名为survivin的蛋白质的帮助。这种蛋白质在癌细胞中含量很丰富，但在正常细胞中却几乎不存在。癌细胞与survivin蛋白的这种依赖性使得survivin自然成为制造新抗癌药物的靶标。Survivin蛋白属于一类防止细胞自我破坏（即凋亡）的蛋白质。这类蛋白质主要通过抑制凋亡酶（caspases）的作用来阻碍其把细胞送上自杀的道路。survivin分子必须与另一个survivin分子的相应部分连结在一起，形成了个二聚物（dimer）才能发挥作用。六．别构效应（allostericeffect）：又称为变构效应，是寡聚蛋白与配基结合改变蛋白质的构象，导致蛋白质生物活性改变的现象。活性蛋白质分子在生物体内刚合成时，常常不呈现活性，即不具有这一蛋白质的特定的生物功能。要使蛋白质呈现其生物活性，一个非常普遍的现象是，蛋白质分子的肽链在一些生化过程中必须按特定的方式断裂。蛋白质的激活是生物的一种调控方式，这类现象在各种重要的生命活动中广泛存在。很多蛋白质由亚基组成，这类蛋白质在完成其生物功能时，在效率和反应速度的调节方面，很大程度上依赖于亚基之间的相互关系。亚基参与蛋白质功能的调节是一个相当普遍的现象，特别在调节酶的催化功能方面。有些酶存在和活性部位不重叠的别构部位，别构部位和别构配体相结合后，引起酶分子立体结构的变化，从而导致活性部位立体结构的改变，这种改变可能增进，也可能钝化酶的催化能力。这样的酶称为别构酶。已知的别构酶在结构上都有两个或两个以上的亚基。七．G蛋白偶联受体信号通路是一个比较有代表性的证明蛋白分子间相互作用或者同一蛋白分子不同亚基间的相互作用的例子。八．研究蛋白质分子相互作用的常用方法：（1）免疫共沉淀（2）亲和层析（3）荧光共振能量转移（FRET）：FRET发生证明两个分子间距离小于10nm，存在相互作用。（4）生物传感器技术，依赖于电脑技术（5）LiangcaiGu,ChaoLi,JohnAach,DavidE.Hill,MarcVidal&GeorgeM.Church.Multiplexsingle-moleculeinteractionprofilingofDNA-barcodedproteins.Nature,21September2014;doi:10.1038/nature13761研究人员利用PRMC复合体（蛋白质-核糖体-mRNA-互补DNA），通过体外的核糖体展示（ribosomedisplay）技术，将DNA条码连到蛋白质上。此外也可以通过催化酶，分别给不同蛋白连上DNA条码。这些自带条码的蛋白可以在水溶液中进行检测。随后，研究人员将上述蛋白固定在聚丙烯酰胺薄膜上，建立起随机的单分子阵列。对条码DNA进行原位扩增可以形成polonies（polymerasecolonies），最后通过DNA测序进行分析。SMI-seq方法能够精确定量多种蛋白，理论上这个阵列的密度可以达到每平方毫米一百万polonies。此外，那些共定位的polonies还揭示了蛋白质之间的互作。为了证明这一技术的有效性，研究人员通过SMI-seq获得了G蛋白偶联受体和抗体结合的图谱。据介绍，SMI-seq是一种“一锅端”式的分析（one-potassay），可以同时检测分子结合的亲和力和特异性。研究显示，SMI-seq技术可以在单分子水平上原位检测蛋白及其复合体，从根本上提升蛋白质分析的灵敏度、准确性和多重性。该技术适用于二代测序平台，这进一步拓宽了它的应用范围。除了天然蛋白、重组蛋白，SMI-seq还可以用于人为生成的新蛋白、核酸和有条码的小分子。