卫生指示菌大肠菌群

(1)检验程序依据《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》(GB4789．3—2010)，第一法的大肠菌群MP’N计数法检验程序见图3-7，第二法的大肠菌群平板计数法检验程序见图3-8。(2)原理1)大肠菌群MPN计数法检验月桂基硫酸盐胰蛋白胨(lauryltryptosebroth，LST)中的胰蛋白胨或胰酪胨提供碳源、氮源、硫和小量的生长因子，磷酸氢二钾(K2HPO4)和磷酸二氢钾(KH2PO4)提供缓冲能力，氯化钠维持渗透压。乳糖是最主要的碳源，几乎所有的大肠菌群计数方法都是基于乳糖发酵实验，乳糖发酵产气是一个主要的筛选条件。所以在大肠菌群的检测培养基中，乳糖就是一个鉴别性成分。月桂基硫酸钠具有选择性，能抑制除了大肠菌群以外的其他微生物。煌绿乳糖胆盐肉汤(brllliantgreenlactosebilebroth，BGLB)含有两种抑制剂，牛胆盐和煌绿染料，它们能抑制革兰氏阳性细菌和产芽孢细菌。同时选择出革兰氏阴性细菌。大肠菌群细菌不受这两种抑制剂的影响，能发酵乳糖并生长繁殖。从产气可以确定发酵反应的进行。使用MPN法的假设前提是细菌随机分布、细菌细胞单个分布(不成串)、有生长繁殖能力和细菌生长有合适环境。相对于平板计数的优势，MPN法接种量大；能检测较少数量的污染；预制的液体培养基是凉的，比直接倒的热的液体培养基危险性小，对检测目标菌的伤害小；可以提前准备培养基。MPN表中阳性管的设定不是连续的，因为有些组合在统计学上的概率非常小，几乎是不可能发生的。如果结果出现了表中没有的组合．应该重新检测，因为很可能结果是错误的。2)大肠菌群平板计数法检验结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar，VRBA)含有蛋白胨提供碳源、氮源．酵母提取物提供B族维生素刺激细菌的生长。胆盐和结晶紫抑制大多数革兰氏阳性细菌。乳糖是碳源，中性红是pH指示剂。(3)应注意的问题1)发酵管灭菌后，最好能在高压灭菌锅内，等待温度降至摩温，若发酵管还是热的就从高压灭菌锅内取出．在室温下降温．倒管顶部会出现小气泡．给检验时观察气体的产生造成困难。建议使用不锈钢或塑料试管帽。可避免硅胶试管塞在灭菌过程中经常会被水蒸汽顶起而脱落，影响灭菌效果的情况。如果使用硅胶塞．有一个经验可以告诉大家，灭菌前，在所有试管的上面盖一块毛巾，要将所有的试管盖住，又不影响灭菌，这样试管塞就不会冲出来了。因为毛巾轻，能允许试管塞向上抬起排气，又能挡住塞子，不让它掉下来，等气排出来后，自然又盖回去了。2)BGLB灭菌后，应及时取出。否则会破坏BGLB中的乳糖成分，使检测效果下降。正常的BGLB取出后是漂亮的亮绿色，如果放在高压锅过长时间不取出．会使其颜色变淡变黄。3)不能直接将样品稀释液接种到BGLB中，因为它的抑制性太强．必须用第一个步骤来使目的菌得到充分的恢复和繁殖。4)酸性样品要不要调整pH，要根据样品而定。可以先测量要使用的LST的pH，然后按正常程序加入样品，再测量pH，如果两者相差不大．还在6．8左右．就不用预先调整样品的pH，因为LST有较强的缓冲能力。5)对产气的观察与判断。刚从培养箱中取出的发酵管，轻微晃动．若有细小气泡从管底迅速升至液面(一般而言，产气量与大肠菌群污染量呈正相关)，即使停止晃动，小气泡也不会停止，那么这就是产气阳性；如果晃动时出现的气泡较大，停止晃动后很快消失，那么这些气泡是晃动时产生的，其实没有产气反应。真正发酵产生的气泡量应较大且是白色的，而晃动产生的气泡数量少、体积大、呈现出液体原来的颜色。晃动的时候一定要用手指轻轻按住试管塞，不然晃动的时候可能因骤然释放大量气体．将塞子顶开，管内液体冲出，造成污染物外溢。对于培养后倒管内出现大气泡(一般认为占倒管的l／3以上)，判断为产气是无容置疑的；对于倒管内的小气泡，则应观察试管内的培养基是否是澄清的，及细小气泡的升腾现象，同时取灭菌后产气泡的空白管进行对照，均符合的才能综合判断为阳性，反之，则应判断为阴性。6)稀释度的选择，参见《食品安全国家标准食品微生物学检验粪大肠菌群计数》(GB4789．392013)的附录B，有非常详细的描述。7)如果VRBA煮沸的时间超过2min，会降低它的分离能力。培养时间不能超过24h，因为受到抑制的杂菌可能在延长培养时川中生长。换言之，它的分离能力和抑制能力在24h内最有效。为了保证最佳的分离效粜，应该在24h内配制和使用。8)接种VRBA平板后必须要覆盏，不然不能形成标准中描述的菌落，结果无从判断。覆盖层是为了造成较低的氧含董．抑制杂陌牛长。