土壤微生物的分离鉴定

土壤微生物的分离鉴定实验报告09级生科一班（周一下午组）安明玉同组者：陈汶灿、程彬、陈肖然、高琳璐、秦瑶一、实验摘要利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据菌落形态观察、染色鉴定以及一系列的生理生化试验的结果通过查阅《伯杰氏系统细菌学手册》对照种属特征最终判断所分离纯化的细菌所属的属。二、实验目的1.学会设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。掌握倒平板和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。2.巩固练习显微镜使用方法。3.明确培养基的配制原理，复习配制培养基及消毒灭菌的一般原理和操作步骤。4.复习掌握细菌稀释分离和划线分离技术，平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌的培养条件和培养时间，复习平板菌落计数法。5.复习掌握细菌的简单染色、鞭毛染色、革兰氏染色的基本原理和操作方法。6.学习并掌握过氧化氢酶测定、细胞色素氧化酶测定和糖发酵与氧化试验的实验原理及其操作方法。三、实验原理1.对土壤中微生物的分离筛选及鉴定从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程成为微生物的分离与纯化，常用的方法有简易的细胞挑取法和平板分离法。本实验采用平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化，其原理包括以下两个方面：(1)在适合于待分离微生物的生长条件（如营养、酸碱度、温度与氧等）下培养微生物，或加入某种抑制剂形成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；(2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得纯培养，获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成。但是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。土壤是微生物生活的大本营，它所含有的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的微生物菌株。2.显微镜的使用及细胞的简单染色和革兰氏染色现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常称为复试显微镜。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，对微生物学研究最为重要，直接影响显微镜的分辨率。与其他物镜相比，油镜的使用方法比较特殊，需要在载玻片和镜头之间滴加香柏油。这样做有两个原因。一是能够增加照明亮度，如果光线只是经过空气进入物镜，会因为工作焦距很短，有些光线发生折射或全反射，进入物镜的光线少而使视野亮度不够；而滴加香柏油后，因为香柏油与玻璃的折射率相仿（玻璃，n=1.5，香柏油，n=1.52），可以保证视野亮度。二是增加显微镜的分辨率。利用单一染料对菌体进行染色称为简单染色。通常用碱性染料进行简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性、弱酸性溶液中通常带负电荷，而染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合壁着色；当细胞处于酸性条件下（如细胞分解糖类产物）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。革兰氏染色，革兰氏染色法是复（特殊）染色法中一种最重要的鉴别性染色法之一。该染色法是先将细菌用结晶紫染色，再加媒染剂碘液媒染以增加染料和细菌细胞的亲和力，使它和结晶紫在菌体细胞壁部位形成分子量较大的紫碘复合物，而后用脱色剂酒精或丙酮脱色，最后再用复染剂番红复杂。如果细菌经脱色剂酒精或丙酮处理后不被脱色而保存初染颜色即紫色，即为“革兰氏阳性菌”；若初染被脱色而染上复染剂番红颜色即淡红色，则为“革兰氏阴性菌”。革兰氏阳性菌的肽聚糖层厚而致密，经过媒染和染色后颜色不易被洗掉，而呈现紫色；而阴性菌肽聚糖层仅1-2层，层薄而疏，与染色剂结合不紧密，颜色容易被洗掉而被番红复复染成红色。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，但在具体操作方法上有多种做法。3.菌株鉴定的生理生化实验（1）糖发酵与氧化试验在细菌的分类鉴定中，糖类发酵与氧化测定是一项重要依据。特别是对细菌的鉴定尤为重要。常用的发酵与氧化的糖类包括单糖，双糖，多糖三类：如葡萄糖，蔗糖，淀粉等。醇类包括五元醇，六元醇;如到金盏花醇，甘露醇等；糖苷类主要包括有水杨苷等。绝大多数细菌都能利用糖类作为能源和碳源，但由于不同的菌类存在酶类差异，已而对糖类发酵与氧化的能力就有所不同。有的能利用这种而不能利用那种，有的正好相反；有的在糖类发酵与氧化代谢中能分解糖类，产酸产气，有的则只能产酸不能产气。酸产生与否，以及时发酵类型产酸还是氧化类型产酸，可以由预先加在培养基中的指示剂（溴百里酚蓝水溶液）呈现出来。这样把接好菌种的培养基放在厌氧或好样的条件下培养，培养基由绿色变为黄色为产酸，是否产气是通过观察培养基中是否产生气泡或培养基断裂来测定，如产生断裂或有气泡证明由气体存在。（2）过氧化氢酶测定乳酸菌和许多厌氧菌与其他细菌区分的主要依据是测定有无过氧化氢酶。过氧化氢酶又称接触酶，它能把过氧化氢分解为水和氧气，氧分子变做气泡跑出来，则为过氧化氢酶阳性。乳酸菌和许多厌氧菌在过氧化氢试验中呈阴性。（3）细胞色素氧化酶测定细胞色素氧化酶是氧化酶中的一种，有时人们习惯的把细胞色素氧化酶称为氧化酶，所以在细菌分类鉴定中所说的氧化酶就是指细胞色素氧化酶。细胞色素氧化酶在右分子氧和细胞色素C存在时，可氧化二甲基对本撑二胺(氨基二甲基苯胺)，使之呈现玫瑰红到暗红色，在此基础上，还能和a-苯酚结合生成吲哚酚蓝，而出现蓝色。四、实验试剂与器材1.器材培养皿、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、恒温培养箱、高温灭菌锅、电子天平、滤纸、pH试纸等。2.试剂牛肉膏、NaCl、琼脂、蛋白胨、葡萄糖、K2HPO3、溴百里酚蓝、甘油（丙三醇）、结晶紫染液、番红染液、碘液、95％乙醇、5％孔雀绿染液、0.5％番红水染液、3％过氧化氢水溶液、1％盐酸二甲基对苯撑二胺溶液、蒸馏水等。3.土样公教楼前绿化带内约5cm深处。五、实验步骤1.配置培养基配置牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯培养基各300mL，包好15个培养皿，6支试管，玻璃铲及移液管，与配好的培养基一起121℃灭菌30分钟。灭菌后将培养基倒入培养皿中（无菌操作），牛肉膏蛋白胨培养基倒9个平板，马铃薯培养基倒6个平板。2.制备土壤稀释液采集土壤样品，称取土壤10g，放入90mL无菌水的三角瓶中，振荡，并用玻璃珠打碎，静置30min，配成土壤悬液。3.配制稀释液用移液管从三角瓶中吸取1ml（此操作要求无菌操作），加入另一盛有9ml无菌水的离心管中，混合均匀，以此类推分别制成0.1、0.01、0.001、0.0001和0.00001不同稀释度的土壤溶液。4.涂布培养倒平板，待平板冷却凝固后，无菌操作，移取0.2ml稀释液至平板培养基上，并充分混匀铺平。其中，牛肉膏蛋白胨培养基（细菌）所接梯度为0（即原液），0.01，0.00001；马铃薯培养基（霉菌）所接梯度为0，0.001。每种各接3板，做好标记。倒置于37℃下恒温培养24~48h。（马铃薯培养基置于28℃培养3天）。观察各个稀释条件下的菌落数（最大稀释度下，保证菌落数不超过30，否则应继续稀释。）计算出每克土壤中细菌的数量:1g土壤中的细菌数量=每皿菌落平均数×稀释倍数×1/取样体积数×95.划线分离土壤稀释溶液微生物的培养基平板进行观察，记录区分明显的细菌特征。细菌培养基上挑取选5个菌落，标记，记录并进行菌落描述，然后将选取的5种细菌在新的培养基中划线培养（每种细菌培养3个培养皿），标号，37°C温箱培养。6.简单染色，观察记录现象，如果细菌不纯，继续平板划线分离直到得到纯菌种。挑取纯菌种接种于斜面培养基上保存。7.半固体穿刺实验，观察菌的运动性。8.芽孢染色，观察记录现象。9.革兰氏染色，观察记录现象。10.生理生化实验（1）淀粉水解实验（2）糖发酵试验11.通过查伯杰手册确定菌属。六、实验结果1.细菌分离鉴定结果（1）菌落计数项目平皿编号平均稀释倍数1g土壤中细菌数123计数14162016.710-515.03×106（2）菌落描述编号大小颜色形状干/湿表面边缘透明程度13.0mm乳白色圆形湿不隆起，不光滑不整齐不透明24.0mm乳白色圆形湿不隆起整齐不透明32.5mm白色圆形湿不隆起整齐不透明46.5mm淡黄色圆形湿略微隆起，表面光滑不整齐稍透明54.5mm乳白色圆形湿不隆起，不光滑不整齐不透明其中4号菌体周围有似粘液的物质包围，且不易挑起。2.染色结果3.半固体穿刺实验编号12345是否运动运动不运动不运动运动运动4.生理生化反应结果（1）淀粉水解实验编号12345现象出现透明圈出现透明圈出现透明圈不出现透明圈出现透明圈结论阳性阳性阳性阴性阳性通过淀粉水解试验可以确定1、5属于芽孢杆菌属，但不同种。（2）油脂水解实验编号12345结果变红变红不变红不变红变红结论阳性阳性阴性阴性阳性（3）糖发酵试验A表示葡萄糖发酵B表示乳糖发酵编号12345ABABABABAB是否产酸+-+-+-+-+-是否产气----------结论：5种菌均可发酵葡萄糖，且产酸不产气；都不能发酵乳糖。染色类型编号12345简单染色直杆状，呈短链直杆状短杆状，呈短链直杆状直杆状，链状排列芽孢颜色形成芽孢，位于菌体中部不产生芽孢不产生芽孢不产生芽孢形成芽孢，稍偏离菌体中部革兰氏染色阳性阳性阴性阴性阳性5.通过查阅伯杰手册，得到的鉴定结果：1号菌：细胞杆状，呈短链，革兰氏反应阳性，有芽孢，运动，淀粉水解测定为阳性，油脂水解测定为阳性，代谢为发酵型，产酸不产气。查伯杰氏手册估计为芽孢杆菌属（Bacillussp.）。2号菌：细胞杆状，革兰氏反应阳性，不产生芽孢，不运动，淀粉水解测定为阳性，油脂水解测定为阳性，代谢为发酵型，产酸不产气。查伯杰氏手册为乳杆菌属（Lactobacillus.sp.）。3号菌：细胞杆状，呈短链，革兰氏反应阴性，不产生芽孢，不运动，淀粉水解测定为阳性，油脂水解测定为阴性，代谢为发酵型，产酸不产气。查伯杰氏手册为不动杆菌属（Acinetobactersp.）。4号菌：细胞杆状，革兰氏反应阴性，不产生芽孢，运动，淀粉水解测定为阴性，油脂水解测定为阴性，代谢为发酵型，产酸不产气。查伯杰氏手册为拜叶林克氏菌属（Beijerinckiasp.）。5号菌：细胞杆状，链状排列，革兰氏反应阳性，有芽孢，运动，淀粉水解测定为阳性，油脂水解测定为阳性，代谢为发酵型，产酸不产气。查伯杰氏手册为芽孢杆菌属（Bacillussp.）。6.通过观察小室培养的霉菌，得到霉菌观察结果：菌种菌丝有无隔菌丝特点有无假根孢子囊、孢囊孢子的形态特征根霉（Rhizopus）无从孢子梗基部发出匍匐菌丝有假根处向上丛生直立、不分枝的孢囊梗，顶端膨大形成圆形的孢子囊。青霉（Penicillium）有营养菌丝无色或淡色无分生孢子梗有横隔，基部无足细胞。孢子梗顶端不形成膨大的顶囊，而是产生帚状体。附录1.牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）的配制：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15-20g水1000mLpH7.0-7.2121℃灭菌2.马铃薯培养基（PDA）的配制：马铃薯40g蔗糖4g琼脂4g水200mlPH自然马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖和琼脂，溶化后补足至200ml，121℃灭菌20min。3.参考文献《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey＇sManualofSystemaicBacteriology）1974年第八版、1986年第9版，主编布瑞德（美）《微生物学》（第2版），主编沈萍、陈向东，高等教育出版社