卵巢衰老研究现状与展望

随着老龄化社会的出现，衰老问题日益受到重视。机体各系统的功能随年龄增长而不断下降，直至衰老。卵巢衰老是一个多因素相互作用、逐渐累积的复杂的生物过程。随着年日逝去卵泡不断消耗，卵泡数目下降是卵巢衰老的主因；而机体内代谢产物堆积卵巢内微环境改变，如自由基、糖基化终末产物对卵泡的损伤，及线粒体DNA突变、端粒缩短等因素的不断累积，剩余卵泡的质量也同时降低；卵巢中一系列基因的表达与功能改变，以及H-P-O轴（Hypothalamus-Pituitary-OvaryAxis，下丘脑-垂体-卵巢轴）激素的分泌精密调控卵巢的功能。卵巢功能衰退即卵巢衰老，以绝经为表现，40岁以前绝经称为卵巢早衰（PrematureOvarianFailure，POF）1，即病理性卵巢衰老。本文将就生理性卵巢衰老即正常女性卵巢的自然衰老，及卵巢储备功能的评价等研究做一综述。1．卵巢衰老与卵泡数目的改变卵巢中的卵泡起始于胚胎初期的生殖细胞，在孕期四个月时，卵巢中有600-700万个卵原细胞（即原始生殖细胞）2,3。孕期六个月至新生儿出生后六个月期间形成始基卵泡池（PrimordialFolliclePool），约100-200万个始基卵泡，即由一个停留在第一次减数分裂双线期的初级卵母细胞及围绕其周围的单层扁平颗粒细胞层所组成3,4。多数卵泡在儿童期闭锁退化，到月经初潮时，卵巢中约有30-40万个卵泡，所剩余的只是出生时的很小一部分2。在育龄期，卵泡数以每个月消耗1000个的速度下降；37.5岁时，卵巢中留有25000个卵泡，这是卵泡数目的临界值；37.5岁以后卵泡数目下降的速度翻倍5,6。正常月经周期的维持需要一定的卵泡数目，在绝经期时卵巢中残留的卵泡数不足1000个5,6。因此，卵巢中的卵泡要么在月经周期中发生排卵形成单倍体的配子，要么闭锁而终。事实上，超过99.9%的卵泡都相继发生闭锁，女性一生中只有400-500个始基卵泡发育成熟并排卵5。尽管近年来有学者研究发现，可能存在生殖干细胞，更新补充卵巢中的卵泡，向始基卵泡池是唯一的卵泡储备库这一观点发出挑战，然而，卵泡总数随着岁月逝去不断下降是个不争的事实7-10。1.1生殖能力与卵泡数目改变的关系女性生育能力的改变主要在于卵巢功能，卵巢衰老则导致不孕，尽管神经内分泌与子宫因素也不可忽略11。年龄相关性不孕的女性借助年轻女性捐赠的卵子可重新获得生育能力，这一事实突显了卵巢的关键地位12。成熟女性随着年龄增长，生育能力逐渐下降，这与卵泡池中的卵泡不断耗竭、卵泡数目下降直接相关。早期统计数据显示，35岁至41岁年龄阶段的女性终生不孕的几率是30岁至35岁女性的2倍13。对照卵泡池卵泡数目的改变规律发现，这正是卵泡数目急剧下降时期，37.5岁时卵泡数目达到一个临界值——25000个，此后卵泡数下降速度是之前的2倍。临近围绝经期，卵泡储备几近耗竭，因此丧失生育能力14。研究表明，从生育能力下降直到绝经期，是一个相对固定的间隔期5。按事件发生的平均年龄计算，即37.5岁到51岁，13年的固定间隔期。而这13年被认为是25000个卵泡消耗到1000个时所需的时间，因此，25000被认为是卵泡数目的一个临界值。ART研究结果佐证了这一观点。促排卵反应性差的女性绝经时间更早，而这些女性当时就可能正处于生殖能力加速下降期到完全丧失期之间15-17。然而，促排卵反应性降低究竟是由于卵泡的质量问题还是数量问题，目前尚存在争议。流行病学调查表明，10%的女性在45岁时绝经18,19。按照13年固定期的理论，45岁绝经的女性，其生育能力在32岁就已开始急剧下降，尽管此时月经周期尚规律，使其无法觉察残酷的现实5。这也是目前部分不明原因不孕的30余岁女性的可能原因。类似的，围绝经期即从不规律月经周期起始到绝经之间，约6年时间，无论绝经年龄大小20。笔者推测这可能也是由于后期一定卵泡数目的消耗所需的固定时间，有待进一步的研究证实。1.2内分泌功能与卵泡数目改变的关系卵巢功能不仅决定女性的生育能力，作为性腺器官同时发挥重要的内分泌功能。卵巢周期性排卵，产生性腺激素，与下丘脑、垂体形成H-P-O轴，协同维持正常的月经周期。卵泡数目与围绝经期月经周期的规律性直接相关，与体内雌孕激素、促性腺激素的水平相互影响。37.5岁至绝经期间，卵泡数目急剧下降是由于FSH水平增高，卵泡生长的募集加快，消耗加速5,21。FSH水平增高，在卵泡期更早达到了阈值水平，减少了优势卵泡的选择和募集时间，从而缩短了卵泡期，使得月经周期相应缩短2,22,23。生殖衰老值得注意的第一个临床表现就是月经周期缩短2-3天2,24。而FSH增高是因为负调控因子Inhibin（抑制素）、AMH（Anti-MullerianHormone，抗苗勒氏管激素）分泌减少5。Inhibin、AMH由未成熟卵泡分泌，随年日逝去卵泡池的消耗主要是未成熟卵泡的减少。因而，体内Inhibin、AMH水平降低，对垂体分泌FSH作用的负调控减弱。FSH增高不仅加快优势卵泡的选择和募集，同时又促使未成熟卵泡的颗粒细胞不适时的成熟，此时卵母细胞尚未成熟，颗粒细胞、卵母细胞成熟不同步导致更多卵泡闭锁，更加快了卵泡的消耗5,25,26。随着FSH的持续增高，这种过程被放大，直到卵泡池耗尽，雌激素水平下降，终至绝经。雌激素水平下降等内分泌学改变与卵巢衰老引起的一系列绝经期症状与诸多老年性疾病，如心血管疾病、骨质疏松、老年性痴呆、肿瘤、肥胖等直接相关。2．卵巢衰老与累积性损伤随着卵泡数量的不断减少，卵母细胞质量也平行性下降，尤其是在女性生育能力出现降低的31岁以后2。卵母细胞减数分裂不分离导致其质量下降，从而引起高龄孕妇早期胚胎非整倍体率增加，且与35岁后流产率增高和染色体异常直接相关2,5。年龄相关性卵母细胞质量下降与诸多因素有关，如胚胎时期生殖细胞形成的差别，女性一生中自由基、晚期糖基化终末产物的推积、线粒体DNA异常、端粒缩短及端粒酶活性下降等损伤因素的不断累积，这些损伤因素对颗粒细胞质量的改变对卵母细胞间接产生影响27。2.1自由基及抗氧化系统机体中存在大量具有高度活性且极不稳定的自由基（FreeRadicals），主要包括活性氧族（(ReactiveOxygenSpecies,ROS）和活性氮族（ReactiveNitrogenSpecies），以及清除自由基的抗氧化系统（Antioxidantssystems）。正常生理状态下二者相互平衡，一旦平衡打破，机体对自由基清除能力降低，造成过量堆积，就出现了氧化应激反应（OxidativeStress,OS）28。自由基是一把双刃剑，既是生理过程中的重要信号分子，也是许多病理过程的罪魁祸首。卵巢中卵母细胞成熟与排卵、卵巢激素分泌、黄体形成及溶解过程都受到自由基的调节与影响29,30。在正常女性月经周期中，存在各类OS的生物标记29；在卵泡发育的各个阶段始基、初级、窦前、优势卵泡及闭锁卵泡中也都可以检测到SOD（SuperoxideDismutase，超氧化物歧化酶）的表达29。在成熟卵母细胞的卵泡液中亚硝酸盐含量明显降低。一氧化氮（NitricOxide,NO）对于卵泡的生长和闭锁都发挥重要作用，低浓度的NO能够阻止凋亡的发生，而病理性的高浓度NO通过产生过氧亚硝酸盐促进细胞死亡。同时，ROS对卵母细胞的损伤作用也不容忽视，影响了卵母细胞的质量；38岁的女性其黄素化颗粒细胞中的抗氧化酶明显降低，女性随着年龄增长生产儿先天异常率增加与此无不关系。在卵巢激素合成过程中，诱导关键酶P450转录的转录因子Ad4BP（Ad4-BindingProtein,Ad4结合蛋白）与SOD的表达相关，提示OS与卵巢甾体激素合成的关联性28-14。黄体中SOD与孕酮的表达水平随黄体的形成过程而平行增长，又随着黄体的溶解而平行性下降29。同时体外实验证实，过氧化氢能够降低HCG刺激的黄素化细胞雌孕激素的分泌28,30。此外，NO抑制黄体中的激素合成，通过增加前列腺素介导融黄体作用。另一方面，ROS同时也受到性腺激素的调节。如绝经后OS更为明显，因为缺少了能够发挥抗氧化效应的雌激素，雌激素能够抵抗低密度脂蛋白的氧化，因此绝经后女性心血管疾病、骨质疏松发病率均有所增高。目前关于自由基和卵巢衰老发生的关系，研究局限性在于相应的检测方法，需要能够分析生物标本中的ROS产物，有关蛋白质组学方法研究蛋白质修饰可能比较有前景31。2.2晚期糖基化终末产物（AGEs）另一个有关年龄相关性卵巢微环境改变而导致衰老的假说就是蛋白质糖化的危害效应11。机体内蛋白质的损伤不仅通过自由基的作用，而且也受到糖基化的影响。非酶类蛋白质糖基化导致AGEs（AdvancedGlycationEnd-products，晚期糖基化终末产物）的形成，AGEs涉及机体衰老的诸多症状，如对皮肤、肺脏、血管及其它器官功能的损害11。AGEs引起组织损害可以直接通过蛋白交联作用，也可以通过AGE受体（RAGE）间接起作用；同时AGEs还被认为是氧化应激状态的一个潜在强诱导剂。新近有学者报道，在生殖衰老小鼠的卵巢中，一个主要AGEs前体的解毒酶活性表达降低；同年另有报道，RAGE在卵巢颗粒、卵泡内膜等细胞中高度表达。目前关于卵巢内AGEs堆积的可能效应及作用机理尚未明了，基于目前研究结果笔者推测可能与血管化作用、氧化应激反应有关，这些作用很可能是通过RAGE间接实现或其它位置途径。2.3线粒体DNA（mtDNA）线粒体在细胞能量代谢和内环境稳态上起着主要的作用，其自身有母性遗传的多拷贝基因组。mtDNA（MitochondriaDNA，线粒体DNA）突变是衰老过程中的一个重要“贡献者”，机体多个器官、组织的衰老如大脑、心肌等都与mtDNA突变无不相干。同样，线粒体的功能状态直接影响卵母细胞的质量、颗粒细胞的功能及受孕、胚胎种植等过程，因此涉及卵巢功能的多个水平11。小鼠试验中发现反复刺激卵巢将诱发氧化损伤及线粒体DNA突变，而且卵母细胞直径与透明带厚度和mtDNA的缺少有关。线粒体基因组编码的基因及线粒体电子传递链在年长女性的卵母细胞中表达丰度更高，而与能量通路及线粒体功能相关的核基因组编码的基因在年轻女性的卵母细胞中表达更高。这一现象与衰老卵母细胞中含有更少的ATP及线粒体形态、功能上缺陷增多这一事实相吻合。38岁以上的女性与年轻女性相比，其黄素化颗粒细胞产生孕激素的能力下降，且颗粒细胞中大量线粒体DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）缺失、损伤11。损伤的线粒体中可见空泡形成、线粒体嵴退化及膜破裂。此外，围绝经期女性月经周期不规律，其中卵巢mtDNA缺失也发挥着一定的影响。2.4端粒及端粒酶2009年诺贝尔生理学、医学奖得主ElizabethBlackburn,JackSzostak,andCarolGreider三位科学家由于揭示了“染色体是如何被端粒和端粒酶保护的”这一理论而获得这一至高的荣誉。端粒与端粒酶在衰老与癌症中的研究正日益受到关注，已证实端粒的缩短导致染色体的不稳定，最终导致机体的衰老32,33。端粒位于真核生物染色体的末端，由DNA和蛋白质构成。在DNA复制过程中，随着每一次细胞分裂，端粒要丢失50-200bp碱基对。当端粒缩短到一定的极限值时，细胞停止分裂而走向衰老死亡，端粒因而被视为“有丝分裂钟”（MitoticClock），控制细胞的增殖能力34。端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白逆转录酶，由RNA及蛋白质组成，激活状态下能发挥逆转录酶活性，在染色体的末端合成端粒DNA，使端粒延长，抵消或延缓端粒随细胞分裂的不断缩短，从而延长细胞的寿命甚至使其永生化。因此端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面发挥重要作用35。当端粒酶相关基因突变或缺失时，会造成各类疾病，如骨髓抑制等36。Kinugawa等37研究发现，正常卵巢组织的端粒酶活性随着年龄增长呈下降趋势，且卵巢组织端粒酶活性在38岁以下的女性中明显高于38岁以上的女性，这可能与卵巢中的卵泡储备有关，