卵巢因子对小鼠卵母细胞发育的影响

卵巢因子对小鼠卵母细胞发育的影响摘要：卵巢因子对卵母细胞发育的影响已成为发育生物学研究的主要内容，卵巢产生的大量生长因子通过自分泌／旁分泌方式对生发泡破裂（germinalvesiclebreakdown，ｇｖｂｄ）、第一极体释放、胚胎发生及早期胚胎发育发挥调控作用。对卵巢因子调控作用的深入研究有助于进一步了解卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中的细胞通讯系统网，寻找治疗不孕不育的新途径和新方法，为体外成熟、体外受精及胚胎干细胞分化制定更加优化的培养环境。概述了目前卵巢因子在小鼠卵母细胞发育调控中的研究进展。关键词：小鼠；卵巢因子；卵母细胞；胚胎；发育tｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｖａｒｉａｎｆａｃｔｏｒｏｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓｇａｏｇｕｏ－ｌｏｎｇ（ｃｏｌｌｅｇｅｏｆｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ，ｇｕｉｚｈｏｕｎｏｒｍａｌuｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｇｕｉｙａｎｇ５５０００１，ｃｈｉｎａ）ａｂｓｔｒａｃｔ：thesｔｕｄｙｏｎｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｖａｒｉａｎｆａｃｔｏｒｓｏｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｏｏｃｙｔｅｓｈａｄｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍａｉｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｂｉｏｌｏｇｙ，ｏｖａｒｉａｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓｆｕｒｔｈｅｒａｃｔａｓｐａｒａｃｒｉｎｅａｎｄ／ｏｒａｕｔｏｃｒｉｎｅｆａｃｔｏｒｓｄｕｒｉｎｇｇｖｂｄ，ｅｘｔｒｕｓｉｏｎｏｆｔｈｅｆｉｒｓｔｐｏｌａｒｂｏｄｙ，ｅａｒｌｙｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｅａｒｌｙｅｍｂｒｙｏｎｉｃｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｏｖａｒｉａｎｆａｃｔｏｒｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｆｕｒｔｈｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｏｆｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｎｅｔｗｏｒｋｓｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｏｏｃｙｔｅｓａｎｄｅａｒｌｙｅｍｂｒｙｏｓ，ａｎｄｔｈｅｓｅｎｅｔｗｏｒｋｓｃｏｕｌｄｌｅａｄｔｏｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｅｓｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，ａｎｄｆａｃｉｌｉｔａｔｅｆｕｔｕｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｉｎｖｉｔｒｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ｉｎｖｉｔｒｏｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ．progressｏｆｏｖａｒｉａｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｍｏｕｓｅｏｏｃｙｔｅｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔwassummarized．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｏｕｓｅ；ｏｖａｒｉａｎｆａｃｔｏｒ；ｏｏｃｙｔｅｓ；ｅｍｂｒｙｏｓ；ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ随着人类不孕不育及动物胚胎工程领域体外受精和体细胞克隆技术研究的逐渐深入，卵母细胞发育机制已经成为发育生物学研究的重要内容之一［１，２］，人们通过对细胞间通讯系统的研究来提高卵母细胞的发育潜能［３－６］。大量的研究证实，内分泌激素可以刺激卵巢产生大量的生长因子，促使卵母细胞成熟及发育，颗粒细胞和卵母细胞也可以产生类似卵巢因子的生长因子促使卵母细胞进一步发育［４，５］,现在卵巢因子对卵母细胞发育的影响已成为发育生物学研究的主要内容。本文就目前小鼠卵母细胞发育过程中发现的卵巢因子的种类、对卵母细胞发育的影响作用、调控方式及所用到的研究方法等综述如下。１卵巢因子的发现及其作用在哺乳动物中，发育卵泡中的初级卵母细胞被阻滞在第一次减数分裂前期的双线期，卵母细胞处于该阶段长达数月甚至数年。随着排卵前内分泌激素分泌水平的逐渐提高，卵母细胞继续减数分裂，进而表现出生发泡破裂（ｇｅｒｍｉｎａｌｖｅｓｉｃｌｅｂｒｅａｋｄｏｗｎ，ｇｖｂｄ）、染色质浓缩及第一极体释放等有助于受精和早期胚胎发育的特征。ｇｖｂｄ和第一极体释放是卵母细胞核成熟的标志，除此之外，卵母细胞也需要细胞质组分的变化来实现胞质成熟，才有利于随后的胚胎发生，并为植入前胚胎的发育做好准备［７，８］。虽然排卵前的促黄体素（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ，ｌｈ）对卵母细胞成熟起最重要和最直接的作用，但由于生殖细胞缺乏ｌｈ受体，ｌｈ和人绒毛膜促性腺激素（ｈｕｍａｎｃｈｏｒｉｏｎｉｃｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ，ｈｃｇ）等并没有直接作用于卵母细胞。ｌｈ／ｈｃｇ对卵母细胞的调节功能可能是通过对ｌｈ敏感的体细胞的旁分泌因子来调控，或者是将卵丘细胞或颗粒细胞产生的细胞信号通过细胞间的紧密连接向卵母细胞传递来完成［９］。后来的研究证实，内分泌激素ｌｈ刺激卵巢产生大量卵巢因子，以促进ｇｖｂｄ的发生，而颗粒细胞和卵丘细胞也可以产生相似的生长因子［４，５］，这些因子有利于卵母细胞受精及植入前胚胎的继续发育。同时，早期胚胎发育过程也包括机体通过自分泌／旁分泌途径产生的大量生长因子和细胞因子的参与［３，１０］。通过对特定基因及其表达蛋白的检测分析，人们不但在卵巢、颗粒细胞、卵丘细胞和卵母细胞中检测到卵巢因子的表达，而且在妊娠动物的输卵管和子宫组织中也检测到卵巢因子及其受体蛋白的表达。卵巢因子不但促使ｇｖｂｄ和第一极体释放，进而完成卵母细胞核成熟，还有可能通过自分泌／旁分泌对胚胎发生及早期胚胎发育产生调控作用。进一步研究卵巢因子在卵母细胞发育中的调控作用有助于了解卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中的细胞通讯系统网，寻找治疗不孕不育的新途径和新方法，为体外成熟、体外受精及早期胚胎发育制定更加优化的培养环境。２主要卵巢因子２．１ｂｄｎｆｂｄｎｆ（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ）最初是从猪脑纯化的小分子碱性蛋白质，是一种脑源性神经营养因子，其对神经细胞的生长发育及保护修复有着重要作用，是神经营养因子家族（ｎｔｆｓ）的一个成员。ｂｄｎｆ分子质量为1３ｋu，由两个成熟亚基以非共价结合方式形成同源活性二聚体，成熟亚基含有１１９个氨基酸残基。同源活性二聚体作为配体，结合受体后，诱导细胞膜上的酪氨酸蛋白激酶受体ｂ（ｔｒｋｂ）形成二聚体和磷酸化，进一步激活细胞内信号，发挥其生物学效应［１１，１２］。与神经生长因子不同，ｂｄｎｆ主要在中枢神经系统，维持神经脊和外胚层基板的感觉神经元，这些神经元对神经生长因子无反应。近年来的研究发现，ｂｄｎｆ与哺乳动物的繁殖机能有着密切的联系，人们发现ｂｄｎｆ及其高亲合力受体ｔｒｋｂ在卵巢组织中表达，而且其表达水平和卵母细胞发育潜能关联性很高。家鸡排卵前卵巢卵泡膜细胞表达ｂｄｎｆ，家鸡排卵前颗粒细胞和小鼠的卵母细胞膜上分别有ｔｒｋｂ表达，ｔｒｋｂ基因敲除的大鼠卵泡发育不良［１３－１５］。在对哺乳动物小鼠和人的研究中，人们发现排卵前ｌｈ分泌量的上升刺激卵泡颗粒细胞产生大量ｂｄｎｆ，ｂｄｎｆ促使卵母细胞第一极体释放并进一步诱导胞质成熟［１６，１７］。关于ｂｄｎｆ在卵巢中的表达及其对卵巢功能的影响研究，无论从基础研究还是临床研究的角度都具有重大利用价值。２．２ｇｄｎｆｇｄｎｆ（ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ）是胶质细胞源性神经营养因子，是几种不同类型的神经元中第一个被确定的存活因子［１８，１９］。ｇｄｎｆ成熟肽均有１３４个氨基酸残基，活性形式为二硫键连接的同源二聚体糖蛋白，能促进神经元尤其是多巴胺能神经元的生长分化，是治疗神经退化性疾病如帕金森症的潜在有效药物。ｇｄｎｆ家族神经营养因子信号传导是通过复合受体途径实现的，复合受体由两部分组成，第一部分是糖基化的磷脂酰肌醇（ｇｐｉ）锚定到细胞表面的蛋白分子，称为ｇｄｎｆ家族受体（ｇｄｎｆｆａｍｉｌｙｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｌｐｈａ１，ｇｆｒａ），另一部分是由原癌基因ｃ－ｒｅｔ编码的蛋白产物（ｒｅｔｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｒｅｔ），它是一种受体酪氨酸激酶［２０］。虽然ｇｄｎｆ及其受体主要在神经系统中大量表达，但人们也在几种边缘组织中发现ｇｄｎｆ及其受体，其中就包括卵巢和睾丸组织［２１］。在睾丸组织中，ｇｄｎｆ参与精原细胞增殖及分化的调控［２２］。通过ｄｎａ芯片分析，ｇｄｎｆ在卵巢、卵丘细胞和颗粒细胞中均有表达，并且其表达水平在排卵前明显上升［１６］。在对小鼠的研究中发现，ｇｄｎｆ作为主要生长因子促进精原干细胞的增殖［２３］。ｇｄｎｆ及其受体ｇｆｒａ和ｒｅｔ在卵母细胞、卵管和子宫中均有大量表达，ｇｄｎｆ促使小鼠卵母细胞第一极体的释放，并通过抑制胚胎细胞的凋亡促使２细胞胚胎向囊胚阶段发育［６］。２．３ｉｎｓｌ３ｉｎｓｌ３（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｆａｃｔｏｒ３）是胰岛素样因子３，是松弛素－胰岛素激素家族的成员之一，由睾丸间质细胞在整个生命周期内稳定分泌产生的一种激素，被认为可能是比睾丸激素水平更敏感的，能显示间质细胞功能状况的指标。ｉｎｓｌ３基因或其受体基因ｌｇｒ８／ｇｒｅａｔ若发生突变，则可能会导致男性患隐睾病［２４］。除睾丸组织外，其他类型的组织中也有ｌｇｒ８／ｇｒｅａｔ基因的表达，在发育成熟的间质细胞中检测到ｉｎｓｌ３，说明ｌｇｒ８／ｇｒｅａｔ－ｉｎｓｌ３激素系统在成年个体内可能还担负其他生理功能。在之后的研究中，人们发现ｉｎｓｌ３在出生前后的睾丸间质细胞和出生后的卵巢中特异地表达［２５］，排卵前的卵母细胞中卵巢因子ｉｎｓｌ３表达水平上升，卵巢因子ｉｎｓｌ３在卵母细胞成熟中发挥了重要作用，其可以激活卵母细胞外围体细胞中ｉｎｓｌ３的受体，引起卵母细胞ｃａｍｐ水平下降，对ｇｖｂｄ的发生具有明显的促进作用［４，５］。２．４ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ最早是从培养的猪主动脉内皮细胞中分离纯化出的活性多肽，由２１个氨基酸组成，分子质量为２４００u，ｎ端是２个二硫键将１－１５、３－１１位置的半胱氨酸连接起来，ｃ端是一些疏水性氨基酸的残基。ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ属于结构同源肽家族，包括ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－２和ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－３，其差别在于个别氨基酸的残基。多项研究证实，ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ不仅存在于血管内皮，维持基础血管张力与心血管系统的稳定，也广泛存在于包括生殖内分泌系统在内的各种组织和细胞中，其在生殖过程中参与生殖活动调控的作用被多次研究报道［２６－３０］。在对大鼠的研究中，ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１能够有效降低氧化亚氮对早期胚胎的损伤［３１］。通过对排卵前卵巢基因芯片的全基因组分析，人们发现ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１在小鼠卵巢组织的表达水平很高，ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１可以促进排卵前卵母细胞ｇｖｂｄ的发生［２７］。ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ有２个ｇ蛋白偶联受体ｅｄｎｒａ和ｅｄｎｒｂ。ｅｄｎｒａ对ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１有很高的特异性，但ｅｄｎｒｂ对ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－２和ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－３均具有一致的亲和力［３２，３３］。可以结合ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１、ａｎｔｉ－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１及ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１特异性受体ｅｄｎｒａ，对ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１在卵母细胞发育中的调控作用进行深入研究。３主要研究方法通过卵巢因子、卵巢因子特异性受体及卵巢因子抗体，结合基因芯片、实时荧光定量ｐｃｒ、ｅｌｉｓａ、免疫组化、卵母细胞体外成熟、体外受精、早期胚胎体外培养、囊胚内细胞团细胞数量及细胞凋亡评估等，可以对卵巢因子在ｇｖｂｄ、第一极体释放、胚胎发生及早期胚胎发育中的自分泌／旁分泌调控作用进行深入研究。３．１卵巢因子在细胞及组织中表达分析运用基因芯片分析鉴定卵巢因子及其特异性受体在卵巢的表达，通过实时荧光定量ｐｃｒ对卵巢因子及其特异性受体在卵巢转录物进行分析，进一步验证基因芯片的结果，ｅｌｉｓａ检测卵巢因子及其特异性受体蛋白在卵巢、输卵管和子宫组织中的表达。分离卵巢表面卵泡中的卵丘细胞、颗粒细胞和卵母细胞，以实时荧光定量ｐｃｒ技术检测卵巢因子及其特异性受体在３种细胞的转录物，运用免疫组织化学方法定位卵巢因子及其特异性受体蛋白在３种细胞中的表达。３．２卵母细胞核成熟评价卵巢获取卵丘卵母细胞复合体（ｃｏｃｓ），通过添加卵巢因子及其抗体，对ｃｏｃｓ和裸卵进行体外培养，研究卵巢因子