原子吸收分光光度法标准操作规程

标准操作文件STANDARDOPERATIONPROCEDURE康远制药KANGYUANPHARMACEUTICAL原子吸收分光光度法标准操作规程序页/总页：1/11颁发部门：质量管理部文件编号：S0P-QC-0006版本号：00生效日期：年月日北京康远制药有限公司BEIJINGKANGYUANPHARMACEUTICALCO.,LTD.审批项目部门或职务姓名签名签署日期起草QC秦剑英年月日审核QC主管乔云丽年月日QA主管张有清年月日质量管理部赵明年月日批准总工程师侯文宇年月日首次分发部门及数量分发部门质量管理部QC室分发数量11分发部门分发数量康远制药KANGYUANPHARMACEUTICAL原子吸收分光光度法标准操作规程序页/总页：2/11颁发部门：质量管理部文件编号：SOP-QC-0006版本号：00北京康远制药有限公司BEIJINGKANGYUANPHARMACEUTICALCO.,LTD.1目的：建立原子吸收分光光度法的标准操作规程，保证操作的正确性。2范围：本标准适用于进行原子吸收测定的供试品。3责任：QC负责对本规程进行实施，QC主管负责对本规程的实施进行监督。4制定依据：《中华人民共和国药典》2010年版二部附录ⅣD《中国药品检验标准操作规范》2010年版5内容5.1简述供试品在高温下经原子化产生原子蒸气时，如有一光辐射作用于原子，当辐射频率相应于原子中电子从基态跃迁到较高能态所需要的能量时，即引起原子对特定波长的吸收。吸收通常发生在真空紫外、紫外及可见光区。原子吸收光谱为线光谱，通过测定该特征波长光谱线的吸光度可以计算出该待测元素的含量。原子吸收一般遵守吸收分光光度法的比尔定律。实验条件固定时特定波长处的吸光度值与样品中原子浓度成正比。但实验参数的变化会影响结果值。原子吸收分光光度法测量对象是成原子状态的金属元素和部分非金属元素。测定的样品一般经高温破坏成原子态，在气态下利用自由原子的光谱性质进行测量，常用在药物中无机元素的测定。5.1.1仪器原子吸收分光光度计主要由光源、原子化器、单色器、检测器、记录显示系统和数据处理系统等部分组成。（1）光源由于原子光谱为线光谱，原子吸收分光光度计的光源应能在窄的光谱范围内有高强度的辐射，否则检测器得不到准确测量信号。因此，需要应用能满足上述要求的线光源。原子吸收分光光度计常用的光源为空心阴极灯。灯的阴极由待分析元素的物质构成，工作时使该元素激发并发射特征光谱。被测元素只能用该元素的空心阴极灯进行分析。（2）原子化器：常用的原子化器有火焰型、电热型、氢化物发生型和冷蒸气型四种。A火焰型原子化器：样品溶液导入雾化器中使试样溶液雾化成气溶腔，并与燃气和助燃气充分混合后在燃烧器上成火焰燃烧，不同物质需要不同能量使其离子态转变成基态的原子。入射光通过基态原子时部分能量被吸收，并由传感器转变为电信号，用记录康远制药KANGYUANPHARMACEUTICAL原子吸收分光光度法标准操作规程序页/总页：3/11颁发部门：质量管理部文件编号：SOP-QC-0006版本号：00北京康远制药有限公司BEIJINGKANGYUANPHARMACEUTICALCO.,LTD.仪进行记录。改变燃气和助燃气种类及比例可以控制火焰温度，以提供使供试品转变成原子状态所需的能量。最常用的混合气体为空气-乙炔。B电热型原子化器：又称无火焰原子化器，其中又以石墨炉应用最广。石墨炉原子化器为用电流控制温度的炉子，其中放入可置放样品的石墨管或其它合适的样品置放装置。在测定过程中炉内通入氩或其它保护气体，以防上炉的氧化。以一定体积的样品溶液加入石墨管后用电加热使其原子化。电加热的过程至少有三个阶段：干燥阶段用略高于溶剂沸点的温度，以较长的时间使溶剂蒸发至干。灰化阶段是去掉比分析元素容易挥发的样品基体以减少背景吸收，根据具体情况选择合适的灰化温度及时间。最后阶段为原子化阶段。温度应升至能使样品转变成气态原子，该阶段的升温速度必须很快，加热时间应尽可能短，以延长石墨炉的寿命。原子蒸气迅速从入射光束通道中扩散出去，形成一个瞬态吸收信号，用记录仪记录。C氢化物发生原子化器：利用某些元素易形成低沸点氢化物的性质而设计的氢化物发生原子化器可以减少或避免因高温导致的背景干扰与化学干扰。As、Sb、Bi、Ge、Sn、Pb、Se等元素在存在还原剂（除另有规定外，通常采用硼氢化钠）的酸性介质中易生成低沸点的易受热分解的氢化物，再依次由载气导入由石英管与加热器组成的原子吸收池中，在石英管中氢化物因受热而分解，并形成基态原子。D冷蒸气原子化器：测汞时，在汞蒸气发生器中，汞离子被还原成汞，然后将汞蒸气直接导入原子吸收池中。(3)单色器：通常用衍射光栅为色散元件。仪器光路应能保证有良好的光谱分辨率和在相当窄的光谱带（0.2nm）下正常工作的能力。单色器的结构与一般紫外可见分光光度计相同。(4)检测器：一般采用对紫外及可见光敏感的宽光谱工作范围的光电倍增管作为检测元件。要求检测器的输出信号灵敏度高、噪声低、漂移小及稳定性好。(5)记录仪和数据处理系统：原子吸收分光光度计常用绘图打印机记录测定结果。数据处理系统需能测量信号积分值和制备标准曲线以及统计计算处理。有的仪器将参数设定和操作系统和数据处理系统放在一起工作。5.1.2背景干扰的消除：背景吸收干扰是原子吸收测定中常见的现象。造成背景干扰的原因康远制药KANGYUANPHARMACEUTICAL原子吸收分光光度法标准操作规程序页/总页：4/11颁发部门：质量管理部文件编号：SOP-QC-0006版本号：00北京康远制药有限公司BEIJINGKANGYUANPHARMACEUTICALCO.,LTD.多种多样，并往往随样品情况的变化而变化。一般认为，背景来源于样品中共存组分及其在原子化过程中形成的次生分子或原子的热发射，光吸收和光散射。其中有些干扰可以通过适当的样品前处理或优化原子化过程的条件得以消除或减少，但许多干扰仍难以避免。必须另辟蹊径，通过改进仪器设计予以克服。背景校正的基本原理是将分析谱线两侧的读数作为背景读数，然后从分析线的峰值读数中扣除之。最常用的背景校正方法有三种：一是连续光源校正法，采用二个光源，主光源为线光源（即空心阴极灯），另一光源为连续光源，在紫外区通常用氘灯。来自线光源的样品光束通过样品时，其吸光度读数为待测元素与背景吸收之和，来自连续光源的参比光束通过样品时测定背景读数，二者之差即为校正的待测元素的吸光度；二是塞曼效应校正法，多电子原子的发射谱线通过强磁场时，由于空间量子化的缘故使谱线发生分裂，分裂后的中心线称π成分，两侧谱线称σ±成分。π成分作为样品光束测定样品和背景的总吸光度。σ±成分作为参比光束测定背景吸收，二者之差即为样品吸收；三是强脉冲自吸校正法，在空心阴极灯的工作周期内依次施加二个不同强度的脉冲，在弱脉冲作用下发射正常的谱线，在强脉冲作用下多谱勒效应和阴极溅射增强，从而使谱线变宽而且引起明显的自吸收，造成辐射能在中心波长处缺失而分布于中心波长的两侧。将弱脉冲作用下的发射谱线作为样品光束，强脉冲作用下的自吸谱线作为参此光束，依次测定吸光度，此实施校正。连续光源校正由于使用双光源，样品光束和参比光束的准直较为困难，导致在高背景时校正不足或补偿过度；另外，当共存元素的吸收线邻近分析线时，也往往造成补偿过度。塞曼背景校正没有上述缺点，但当样品浓度较高时，工作曲线向浓度轴弯曲。强脉冲自吸校正效果较好，但仍存在高浓度时工作曲线弯曲及灯寿命缩短等缺点。5.2原子吸收分光光度计的检定5.2.1波长准确度与重复性：根据中华人民共和国国家计量检定规程JJG694-90的规定，双光束原子吸收分光光度计的波长示值误差应不大于±0.5nm，波长重复性优于0.3nm。波长准确度与重复性检定方法按空心阴极灯上规定的工作电流，将汞灯点亮稳定后，在光谱带宽0.2nm条件下，从汞、氖谱线253.7、365.0、435.8、546.1、640.2、724.5和871.6nm中按均匀分布原则，选取3～5条逐一作3次单向（从短波长向长波长方向）测量最大能量波长示值，计算谱线波长测量值与标准值的平均误差。波长重复性康远制药KANGYUANPHARMACEUTICAL原子吸收分光光度法标准操作规程序页/总页：5/11颁发部门：质量管理部文件编号：SOP-QC-0006版本号：00北京康远制药有限公司BEIJINGKANGYUANPHARMACEUTICALCO.,LTD.为/次测定中最大值与最小值之差。5.2.2分辨率：仪器光谱带宽为0.2nm时，应可分辨锰279.5nm和279.8nm的双线。分辨率检定方法将锰灯点亮，稳定后在光谱带宽为0.2nm时调节光电倍增管的高压，使279.5nm谱线能量读数为100。扫描测量锰双线，应能分辨出279.5nm和279.8nm两条谱线，且两线间峰谷能量应不超过40%。5.2.3基线稳定性：火焰原子化法测定30min内静态基线和点火基线的稳定度，应不大于下表的指标。火焰原子化法静态基线和点火基线的稳定度项目使用中仪器（吸光度）静态基线最大零漂±0.006最大瞬时噪音（峰-峰值）0.006点火基线最大零漂±0.008最大瞬时噪音（峰-峰值）0.008（1）基线稳定性检定法A静态基线稳定性的测定：光谱带宽0.2nm、量程扩展10倍、点亮铜灯，原子化器未工作状态下测定。单光束仪器与铜灯同时预热30min，用“瞬时”测量方法，或时间常数不大于0.5s，测定324.7nm谱线的稳定性。双光束仪器预热30min、铜灯预热3min后，按上述相同条件测定。B点火基线稳定性的测定：按测铜的最佳条件，用乙炔/空气火焰，吸喷去离子水10min后，在吸喷状况下重复（1）A的测量。5.2.4边缘波长能量：带宽为0.2nm，响应时间不大于1.5s条件下，对砷193.7nm和铯852.1nm谱线进行测量，谱线的峰值应能调到100%，背景值/峰值应不大于2%。5min内谱线的最大瞬时噪声（峰-峰值）应不大于0.03A。谱线能量为100%时，光电倍增管的高压应不超过最大高压值的85%。5.2.5火焰法测定铜的检出限［CL(n=3)］和精密度（RSD）使用中的仪器应分别不大于0.02μg/ml和1.5%。(1)检出限的检定：仪器参数调至最佳工作状态，用空白溶液0.5mol/LHNO3调零，分别对3种铜标准溶液（0.05、1.00、3.00μg/ml）各进行3次重复测定，取3次测定平均值，按线性回归法求出工作曲线的斜率，即为仪器测定铜的灵敏度（S）。康远制药KANGYUANPHARMACEUTICAL原子吸收分光光度法标准操作规程序页/总页：6/11颁发部门：质量管理部文件编号：SOP-QC-0006版本号：00北京康远制药有限公司BEIJINGKANGYUANPHARMACEUTICALCO.,LTD.S=dA/dc[A/（μg/ml）]在上述条件下，扩展标尺10倍，对空白溶液（或浓度3倍于检出限的溶液）进行11次吸光度测量，并求出其标准偏差（SA），计算铜的检出限如下CL（n=3）=3SA/S（μg/ml）（2）精密度的检定:在（1）测定中选择标准溶液之一，其吸光度在0.1～0.3范围进行7次测定，求出相对标准偏差（RSD），即为仪器测铜的精密度。5.2.6石墨炉法测定镉的检出限［QL（n=3）］，特征量（C.M.）和精密度（RSD），使用中的仪器应分别不大于4pg、2pg和7%。（1）检出限和特征量的检定:仪器参数调至最佳工作状态，分别对空白溶液（0.5mol/LHNO3）和3种镉标准溶液（0.50、1.00、3.00ng/ml）各进行3次重复测定，取3次测定平均值后，按线性回归法求出工作曲线的斜率，即为仪器测定镉的灵敏度（S）。S=dA/dQ=dA/d（c×V）（A/pg）式中c为溶液浓度（ng/ml）；V为取样体积（μl）。上述条件下对空白溶液进行11次吸光度测定，并求出其标准偏差（SA）。计算镉的检出限如下QL（n=3）=3SA/S（g）仪器测定镉的特征量计算如下C.M.