动物寄生虫病PCR诊断技术

1动物寄生虫病PCR诊断技术聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）技术是一种既敏感又特异的DNA体外扩增方法，它可将一小段目的DNA扩增上百万倍，其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或仅部分虫体的微量DNA。通过设计种、株特异的引物，此法只扩增出种、株特异的PCR产物，具有很高的特异性。而且PCR技术的操作过程也相对简便快捷，无需对病原进行分离纯化；同时可以克服抗原和抗体持续存在的干扰，直接检测到病原体的DNA，既可用于虫种、株的鉴别，动物寄生虫病的临床诊断，又可用于动物寄生虫病的分子流行病学调查。随着PCR技术的不断完善与发展，它已广泛应用于分子生物学、生物技术、临床医学等各个领域，具有广泛的应用前景。一、实验目的要求掌握PCR诊断技术所涉及实验的基本原理，全面熟悉PCR诊断技术的操作过程，其中包括寄生虫DNA的提取、PCR引物的设计、PCR条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电泳及结果分析、PCR产物的纯化等等。二、实验仪器和材料（一）寄生虫基因组DNA的提取及纯化1.虫体材料。单个虫体。2.器具。超净工作台、恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、旋涡振荡器、微量取液器及配套吸头、微量离心管、一次性注射器、微型眼科镊、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有机架等。3.试剂。(1)乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）、十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfate，SDS）、三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸（Tri(Hydroxymethyl)Aminomethane-HCl，Tris-HCl）、氯化钠、蛋白酶K（25µg/µl）、异丙醇（80%）、双蒸水、灭菌超纯水等。(2)DNA裂解液：500mMNaCl70µl、100mMTris-HCl（pH8.0）30µl、50mMEDTA（pH8.0）150µl、10%SDS30µl。(3)WizardTMDNAClean-Up试剂盒或类似的DNA提取试剂盒。（二）PCR扩增及琼脂糖电泳1．材料。提纯的虫体DNA。2．器具。超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器（2/20/200/1000µl）、PCR扩增仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管（200/500/1500µl）、有机架、一次性手套、透明胶带、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）等。3．试剂。(1)10×PCRBuffer（无Mg2+）、dNTP（2.5mMeach）、ddH2O、MgCl2（25mM）、Primers、ExTaq酶（5U/l）、琼脂糖、EB（10mg/ml）、Tris碱、硼酸（Boricacid）、去离子水、EDTA（0.5mol/L，pH8.0）、10×载样缓冲液。(2)0.5×TBE缓冲液：准确秤取Tris碱5.4g，硼酸2.75g，充分溶解于800ml去离子水中，加10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），用去离子水定容至1000ml。（三）PCR扩增产物的纯化1．材料。PCR扩增产物。2．器具。TGL-16G高速台式离心机；三用电热恒温水箱；微量取液器（2/20/200/1000µl）、琼脂糖电泳系统、微波炉、电子天平、4℃/-20℃冰箱、紫外透射仪、微型离心管（500/1500µl）、有机架、透明2胶带、一次性注射器、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）、手术刀、保鲜纸等。3．试剂。琼脂糖；0.5×TBE缓冲液；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒；UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒；异丙醇（80%）等。三、实验方法、步骤和操作要领(一)寄生虫基因组DNA的提取及纯化1.实验原理。应根据研究目的来决定是从单个虫体还是多个虫体提取基因组DNA。寄生虫虫体的各个部位都可以作为基因组DNA的抽提材料，如果虫体较大的话可取其中部而保存其头部及尾部，以备形态学鉴定以验证其种类。如果虫体较小（小于1cm），则应使用整条虫体抽取DNA。若虫体特别细小（例如幼虫），可用多条虫体来提取DNA。为了获得高含量、高纯度的DNA，最好使用新鲜材料。从冻干或50%-70%乙醇保存的寄生虫材料中也可较容易地提取DNA。寄生虫DNA的抽提方法有多种，不同种类的寄生虫虫体都有其最适合的抽提方法，但各种方法的基本原理都一样，即先用机械的方法将虫体组织破碎，然后加入DNA裂解液和蛋白酶K，充分作用后，虫体组织中的细胞膜破裂，蛋白质变性，将虫体基因组DNA释放到溶液中。在裂解过程中，虫体细胞碎片及大部分蛋白质会相互缠绕成大型复合物，后者被DNA裂解液中的SDS包盖，通过离心沉淀，这些复合物会从溶液中沉淀下来，变性剂也同时被除去，从而就可从上清中回收虫体基因组DNA溶液。回收后的虫体基因组DNA液用WizardTMDNA纯化试剂盒进行纯化。纯化时，DNA溶液与纯化试剂盒中的清洗树脂混合后，其混合液在通过微型柱时DNA会结合在柱上，而其它杂质会通过微型柱排出；再用80%异丙醇进行冲洗，去除残余杂质。最后，在微型柱中加入预热的TE缓冲液或超纯水，使结合在微型柱上的DNA充分溶解，通过离心，其洗脱液即为纯化的虫体基因组DNA溶液。2．实验方法、步骤和操作要领。(1)虫体材料的处理(若为新鲜或冻干保存的虫体，则不需要此步骤)。若虫体较大，用镊子将保存在70%的酒精溶液中的虫体材料取出，剪取其中部，保存其头端或尾端部分。用双蒸水反复吹打冲洗2次后，再用超纯水反复冲洗2～3次，置于一新的1.5ml的离心管中。若虫体较小，取一整条虫体经如上洗涤处理。对于鸡球虫，将保存在2.5%重铬酸钾溶液的卵囊悬液以2000×g离心10min，弃重铬酸钾溶液。以双蒸水重悬，同法离心洗涤三次后，用20%次氯酸钠处理卵囊20min，2000×g离心沉淀卵囊，用适量饱和盐水重悬卵囊沉淀，1500×g离心10min，上清液加入4倍体积的灭菌双蒸水，3000×g离心10min。卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗涤一次。用少量灭菌双蒸水重悬卵囊沉淀，然后将其轻轻地加在0.6M无菌蔗糖溶液之上，2000×g离心5min，取上层卵囊加5倍体积的水，3000×g离心10min，沉淀再用无菌蔗糖溶液漂浮一次，即可得纯净的卵囊，可立即用于裂解以提取DNA。(2)虫体材料的裂解。用灭菌且经紫外灯照射过的微型眼科剪刀将虫体组织剪碎，加入280µl的SDS裂解缓冲液，轻轻混匀，再加入20µl（25µg/µl）的蛋白酶K溶液。对于原虫如鸡球虫、隐孢子虫，将纯化好的卵囊3000rpm/min离心10min，去掉大部分上清后加入与卵囊体积相同的玻璃珠，漩涡震荡直到有95％卵囊破壁后，即可加入SDS裂解缓冲液及蛋白酶K溶液。混匀后，放于恒温培养箱中，37℃作用12～48h，其间不时摇动离心管，使虫体组织裂解充分。(3)虫体DNA的抽提和纯化。首先进行虫体DNA提取，然后按Promega公司试剂盒WizardTMDNAClean-UpSystem使用说明对DNA进行纯化。方法如下：①取出于恒温培养箱中作用了约20小时的离心管，旋涡震荡器震荡混匀，10000rpm离心2min，上3清即为虫体DNA溶液。将上清转移至一新的离心管中，加入1ml清洗树脂（按50～500µl悬液/1ml清洗树脂的比例），旋涡震荡混匀。②取一支5ml的一次性注射器，去针头，拔出注射器内芯推液筒，接上WizardTM微型柱。③将DNA-树脂混合液全部转移到注射器中，用注射器内芯推液筒，慢慢地将DNA-树脂混合液推过微型柱，排出废液。④将注射器从微型柱上拔出后，拿去注射器内芯推液筒，再将注射器套在微型柱上，向注射器内加入2ml柱洗溶液（80%的异丙醇），用注射器内芯推液筒慢慢将洗柱液通过微型柱，以洗涤DNA-树脂样品。⑤拔去注射器，将微型柱套在洁净的1.5ml离心管上，10000rpm离心20sec，以除去残留的异丙醇。⑥将微型柱从注射器上转移到一新的离心管上，在柱中央加入30～50µl预热（60～70℃）的超纯水或1×TE缓冲液，静置1min，10000rpm离心20sec。离心管内的液体即为DNA溶液。可将DNA溶液转移至0.5ml离心管中于-20℃冰箱保存备用。（二）寄生虫DNA的PCR扩增及琼脂糖电泳1.实验原理。(1)PCR引物设计。PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核甘酸引物的正确设计。PCR引物设计的目的是找到一对合适的寡核甘酸片段，使其能有效地与目的片段两端的序列互补。设计引物时要遵循以下原则：①长度不能太长，也不能太短，一般在18～25个碱基左右；②G+C含量及Tm值：引物的G+C含量以40%～60%为宜。引物的Tm值是指寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下50%寡核苷酸双链的解链温度。PCR引物应保持合理的G+C含量。含有50%G+C的20个碱基的引物其Tm值约界于56～62℃，这可为有效退火提供足够的温度。由于G+C间的氢键数较A+T间多，因此，G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。对于短于20个碱基的引物，Tm值可按Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值的计算较为复杂。由于PCR扩增的特异性取决于两条引物与相应模板的结合，因此，反应中退火温度应根据两个Tm值折衷选择。③碱基的组成尽量随机，尽量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；尤其是3’末端不应超过3个连续的G或C；④引物内部不应有互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构或引物本身复性。这样二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若引物自身连续互补碱基达3个以上，就容易形成发夹结构。⑤两个引物之间不能互补，尤其应避免3’末端的互补重叠以防止形成引物二聚体。两个引物不应有4个以上的碱基连续相同或互补；⑥引物的3’末端应与目的片段完全相配。这对于获得好的扩增结果非常重要。如果能确定一个保守氨基酸，可将其密码子的前2个碱基作为3’末端。⑦引物的5’末端可不与目的片段互补，可被修饰而不影响扩增的特异性。引物的5’末端修饰包括：加酶切位点，标记生物素、荧光、同位素、地高辛等。还可引入蛋白质结合DNA序列、引入突变位点、引入翻译起始密码子、启动子序列等。所附加的限制性酶切位点应是不会在引物以外的DNA上切割的。为了有效地切割限制性酶切位点，在限制性酶识别序列的5’端常需添加2-3个非特异的额外碱基。⑧若是设计种或株特异性引物，引物与非特异序列的相似性不能超过70%或有连续8个以上的互补碱基相同。可用DNAstar、MegAlign软件比较相似性，用Oligo50来设计引物。(2)PCR的基本原理。在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液（Mg2+）的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引4物之间的变性，退火（复性），延伸三步反应为一周期（cycle），循环进行，使目的DNA片段得以扩增。由于每一周期所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加，经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍。在实际应用中，一般多用30～35个循环。(3)琼脂糖电泳的基本原理。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，于沸水中溶解，45℃开始形成多孔性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场的作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA含量成正比。2.实验方法、步骤和操作要领。(1)PCR扩增。先按单倍扩增体系中各试剂的量计算好n倍（除去模板DNA量）扩增体系中各试剂相