动物细胞培养预习报告-2-原代培养

预习报告—第8组原代培养实验器材器材：青霉素瓶，烧杯，三套手术器械（1：眼科弯镊两把；2：眼科剪一把；3：眼科弯镊两把），眼科直剪，镊子，酒精，酒精棉，泡沫塑料板，大头针，纱布，棉绳，牛皮纸，胶头吸管，超净工作台，废液缸，37℃CO2恒温培养箱，打火机溶液：酒精，碘酒，Hanks液，培养液。实验步骤一、无菌室准备1、实验环境无菌处理：（1）无菌室消毒：定期清洁，用过氧乙酸熏蒸，紫外线消毒1小时。（2）超净台消毒。（3）实验者准备：紫外灯关闭30min钟后，实验者在缓冲区内穿白大褂，戴口罩，帽子，洗手，泡手，（穿隔离衣），酒精擦手，拿好实验物品进入无菌室（洗手后手不要再碰缓冲区内其他物品，开门由未完成准备的同学帮忙）。2、无菌技术要领：（1）手指不可触及器材使用端；（2）器材使用端经火焰消毒使用；（3）打开或封闭瓶口，安装吸管等都必须在无菌区进行；（4）开口瓶必须顺风45°斜放，用后及时关闭。3.、实验器材无菌使用：（1）血清瓶取用：右手持镊子过火，左手打开容器（不要放下盖子），镊子掀开纱布，取出血清瓶置于台面，镊子过火，扯回纱布，盖好盖子，镊子过火，放回酒精瓶。血清瓶使用之前，瓶盖放在酒精棉球上，瓶口灼烧灭菌后使用。（2）吸管使用：左手持筒，右手取下筒口包装，倒置于安全区内桌面。消毒筒口，左手抖动至吸管长处筒口，右手取管，左手消毒筒口，右手取筒口包装重新套于筒口，将吸管筒放置于远处。此过程中，右手吸管保持管口斜向外上，减小污染几率。吸管吸出液体不要太多，移液时要注意吸管口要保留一段空气柱。移液时吸管不要伸到瓶里放液，而是瓶口微斜，在瓶口外放液。二、超净台操作1、台面准备：台面消毒，点燃酒精灯放在左手边，装有手术器械的酒精器皿在酒精灯右侧摆放，再往右摆放酒精瓶，废物瓶，最右是hanks液，这样所有的物品就在自己的面前。用来再消毒的酒精器皿则摆放在另一同学工作区。2、在超净台外，处死乳鼠（断颈），消毒（提起尾巴，在75%酒精的烧杯中旋转3s左右，心里默数5下），取出放在灭菌的培养皿中，移入超净台。3、取材（甲同学主要操作）：在靠近酒精灯的位置（整个实验过程都要在安全区内进行）。在泡沫塑料板上固定乳鼠（仰位固定，用酒精瓶中的镊子夹着大头针进行固定，先固定鼠头，然后两上肢，最后鼠尾），消毒（用碘酒棉球消毒胸廓部位皮肤，在乳鼠胸廓部位从里到外转一个圈就好）。取出手术器械（先取出第一套手术器械：两把眼科弯镊），皮肤外翻（双手拿镊子夹起乳鼠胸部皮肤向头部尾部两侧撕拉，注意不要使表皮面接触胸腹肌），第一套手术器械再消毒（乙同学进行，放在另一加盖器皿中消毒）。酒精消毒胸廓，取第二套手术器械（眼科剪），沿着隔膜剪开胸廓，并将胸骨两侧肋骨剪断，暴露胸腔。第二套手术器械消毒（乙同学进行）。准备hanks液的青霉素瓶（丙同学进行）。取第三套手术器械（弯镊），取出心肺组织（眼科镊弯头向上，从心脏右上方插入心肺连接处，向上轻轻用力，将心肺一起取出，镊子去除心脏，放入加有Hanks液的青霉素瓶中）4、漂洗（甲同学主要操作）：用Hanks液漂洗肺脏表面脏污（吸管吹吸hanks液进行漂洗）。取出眼科直剪，粗剪几下。在用吸管吸取hanks液漂洗多次（5次）。吸管吸取多余液体（吸管吸取的液体放入废物缸，注意吸管头不要伸入废液缸；青霉素瓶中剩余液体很少时，可以将有组织块的地方转向上方，吸管吸取下部的液体）5、剪切（甲同学操作）：组织块在青霉素瓶的一角，用眼科直剪反复剪切组织块成1立方毫米大小，此过程持续20-30min（为保持组织块湿润，可以向组织块滴加2滴血清培养液）。剪完后，加少量培养液到组织块中。在剪切过程中，乙同学开始进行他的乳鼠取材漂洗的工作，甲同学剪切完成后，眼科直剪清洗干净，酒精消毒，乙同学进行使用。此时，丙同学进行取材漂洗。6、取培养瓶，标记（七-8，原代，2016.3.25）用吸管头将组织小块移入培养瓶中，块间距0.3cm左右，25ml培养瓶20-30块最适。甲乙丙三个同学都放完后，轻轻翻转培养瓶，瓶接种面向下，吸管加入2.5-3ml的培养液后，盖上盖子（主要不要盖得太严实，留缝隙通风）。放入37℃5%CO2培养箱中进行培养。7、1h后，组织小块固化。这时将培养瓶轻轻翻转，液体慢慢覆盖组织小块，继续静置培养。（注意：培养瓶的瓶盖都没有盖严，小心培养液漏出）三、分工情况甲：乙：丙：三位同学都要轮流进行原代培养操作，除了中间的器材消毒和装hanks液部分由同伴完成之外，其余都由主操同学独立完成。具体分工在步骤中已写明。