动物细胞工程具体到分参考资料

动物细胞工程分值分布条四、考试内容及分值第一章绪论（共2分）第二章动物细胞工程基础（共5分）1.精子的形态与结构（2分）1.细胞核——精子头部的主要部分2.高尔基体——头部的顶体3.中心粒——精子的颈部4.线粒体——线粒体髓鞘，精子尾部中段5.细胞内其他物质——原生质滴哺乳动物精子主要由头部、颈部和尾部3部分组成2.卵子的形态与结构（3分）卵子发生场所：卵巢第三章动物细胞工程研究方法（共4分）1.形态学技术（1分）测定细胞大小，细胞计数，利用显微镜观察细胞形态，电子显微镜观察亚细胞结构，细胞膜的渗透性，细胞内氧化还原酶的原位显示2.免疫组织化学技术（1分）3.流氏细胞术（1分）用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术4.梯度离心分离技术（1分）利用颗粒大小的不同:差速离心法（用于分离大小、形状显著不同的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离），速度区带离心法（用于分离密度相近而大小不一的组分）利用颗粒密度的不同:等密度离心法（按细胞组分浮力密度不同进行分离）第四章动物细胞培养（共25分）1.动物细胞培养技术中的相关概念（5分）动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。主要有细胞培养与组织培养原代培养：从体内取出组织或细胞接种培养到第一次传代的操作过程传代培养：细胞培养增殖到一定密度时，将细胞重新悬浮，经稀释后接种到新的细胞培养瓶中的过程称为传代培养细胞一代时间：指从细胞接种到下一次分离、悬浮再培养时的时间细胞系：初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞称为细胞株细胞转化的检测：软琼脂培养法，浸润性检测法，异种动物接种检测法2.动物细胞培养用液（5分）培养基：天然培养基（血清）优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响实验产物的提取和实验结果的分析，合成培养基优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足细胞生长需要。无血清培养基，无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。平衡盐溶液：BSS是从Ringer生理盐水发展起来的，主要由无机盐和葡萄糖组成。Hanks液和Earle液是配制各种培养液最常用的基础溶液胰蛋白酶溶液：主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散抗生素液，消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，或胰蛋白酶抑制剂能终止胰蛋白酶对细胞的继续作用。0.02％EDTA与胰酶液搭配使用可增强其消化效果3.动物原代细胞培养（7分）组织块原代培养贴壁细胞原代培养取材单细胞分离细胞计数接种培养贴壁细胞的传代体外培养细胞的纯化悬浮细胞的纯化：密度梯度离心。依据贴壁速度的纯化：如巨噬细胞等。依据对消化酶的敏感性4.动物细胞传代培养及培养结果检测（8分）细胞形态学观察光镜：培养基颜色、澄清度、细胞形态电镜：微绒毛、桥粒、细胞骨架、核等生长与增殖特性检测生长曲线法细胞活力测定：MTT法细胞分裂指数法克隆形成率第五章动物细胞融合与杂交（共15分）1.细胞融合的原理和方法（7分）细胞融合：自然或人为条件下，两个或两个以上细胞相互接触，发生膜融合、胞质融合和核融合形成融合细胞的现象方法：病毒诱导法融合法①需培养大量病毒，若灭活不充分，可能感染操作者②融合率比较低,可重复性不够高化学诱导融合法PEG诱导细胞融合的特点：①容易制备和控制，活性稳定，使用方便，融合能力强②有毒，易损伤细胞电融合法电融合的特点①融合频率高，操作简便快捷，重复性强，对细胞伤害小②正弦交变电场对细胞的长时间作用会损伤细胞③非特异性融合2.B淋巴杂交瘤技术生产单抗（8分）基本原理：正常的可产生抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞在融合剂的作用下产生融合，杂交的细胞在HAT选择培养基中进行培养，得到的为杂交瘤细胞，该细胞既具有可分泌抗体的功能又可在体外大量增殖的能力单克隆抗体的大量生产体外法：使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。体内法：体内接种杂交瘤细胞，制备腹水第六章动物干细胞（共11分）1.干细胞相关概念及成体干细胞（3分）干细胞（Stemcell）是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,能产生表型和基因型与自己完全相同的子细胞，并具有不同分化潜能。成体干细胞：骨髓造血干细胞HSC，间质干细胞MSC，神经干细胞NSC2.胚胎干细胞的分享、培养与定向分化（8分）主要步骤包括：1.培养体系的选择和准备2.胚胎采集3.ICM的获取4.ICM的离散5.ESC的建系常用饲养层细胞为成纤维细胞（如STO成纤维细胞系）、子宫内皮细胞、3T3细胞株等胚胎的来源：受精囊胚（包括单精注射胚）；孤雌激活胚；体细胞核移植胚。高质量囊胚的标准：囊胚腔充分扩张；滋养层完整，呈连续单层状态；ICM明显，细胞数量多且致密。胚胎干细胞定向诱导分化的方法改变细胞的培养条件:改变细胞的培养条件是ES细胞定向分化的基本策略导入外源性基因,使其分化为某一特定类型的细胞。体内定向分化,使ES细胞多数分化为该组织特异性的细胞第七章动物细胞冷冻与保存（5分）1.冷冻技术原理（3分）冷冻对细胞器的影响（p168）（1）生物膜：通透性改变；膜蛋白被释放，并伴有酶的释放和失活；膜脂由液晶态排列转为凝胶态排列。（2）线粒体：不能进行正常的物质代谢，得不到正常的能量供应。（3）对酶的影响：酶失活2.不同细胞的冷冻保存方法（2分）生殖细胞的冷冻保存精子：（1）细管型（2）安瓿型（3）颗粒型卵母细胞的冷冻保存:慢速冷冻法,快速冷冻法,一步冷冻法,超快速冷冻法,玻璃化冷冻法早期胚胎的保存与冷冻:常规慢速冷冻,玻璃化冷冻方法第十一章动物生殖细胞工程（共15分）1.精子的获取与分离及体外获能处理（3分）采精方法一般假阴道法分离：离心分离法，电泳分离法，免疫学分离法，流式细胞仪分离法获能：预先制备获能液微滴（400ul）,取附睾尾精液注入获能液微滴中（108/滴）CO2培养箱中孵化1-2h。获能用物质：咖啡咽，肝素，钙离子载体，BSA2.卵母细胞的获取与成熟（3分）获取：20g小鼠腹腔注射5-10IUPMSG做超排处理，48小时后屠宰取卵巢，显微镜下解剖针挑破卵泡，捡卵针捡卵。卵母细胞的体外成熟培养：采用微滴培养法：1）微滴的制作2）培养密度：10-15枚/100ul微滴3.第一代试管动物技术（3分）?4.第二代试管动物技术（3分）显微受精技术又称为第二代试管婴儿技术，它主要是为了解决由于雄性动物精子活力不足或精子密度减少而无法穿越卵母细胞卵丘颗粒细胞层、透明带及卵质膜三重障碍而导致的不孕问题而产生的技术。5.受精卵的早期培养（3分）1.培养方法：CO2培养箱中微滴培养法。2.培养时间与胚胎发育：不同动物不一。第十二章动物胚胎细胞的早期操作（共18分）1.胚胎移植技术（8分）概念：借助一定的器械，从一头优良雌性动物的输卵管或子宫内取出早期胚胎，移植到另一头处于相同生理阶段的雌性动物的相应部位，使之继续发育成为新个体。即借腹怀胎。2.胚胎分割技术（2分）运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术，运用胚胎分割可获得同卵孪生后代。胚胎分割方法：1）willadsen法2）williams法3.嵌合体技术（2分）嵌合体：同一个体中同时存在不同基因型的细胞或组织，这种个体成为嵌合体。胚胎嵌合：把两个或多个不同基因型的早期胚胎（细胞）聚集在一起形成复合胚胎，进而发育为不同程度嵌合个体的过程。4.早期胚胎性别鉴定技术（2分）PCR扩增法,囊胚抑制法,FISH荧光原位杂交,LAMP法5.核移植技术（4分）通过显微操作的方法，将供体细胞的细胞核放入预先去核的卵母细胞或早期受精卵中，形成一个新的核质重组胚，供体核在受体胞质作用下，发生发育程序重编，使得重组胚得以分裂、分化并最终发育成一个新的个体。供体细胞的类型：1）胚胎细胞：早期胚胎细胞、ICM2）胚胎干细胞3）体细胞常用的体细胞：乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞、卵丘颗粒细胞、输卵管上皮细胞、皮肤成纤维细胞等。