含RGD序列环肽的设计与合成方法研究

含RGD序列环肽的设计与合成方法研究初虹，陆冬冬（苏州中科天马肽工程中心有限公司，苏州215101）摘要：目的介绍含RGD序列的环肽的设计与合成方法。方法二硫键成环、酰氨键成环和click反应成环是含RGD序列环肽的主要成环方式。结果三种方法应用越来越多，易于得到低消旋，高产率的产物。结论设计与合成有高稳定性和高生物活性的含RGD序列的环肽是含RGD类多肽研究的主要方向。关键词：RGD序列;环肽;合成;Click化学反应近些年，人们对含RGD序列的环肽及其类似物的研究越来越热。RGD序列即含有精氨酰-甘氨酰－天冬氨酸（Arg-Gly-Asp)的三肽序列，该三肽序列是细胞中粘附蛋白的功能序列，最初是在细胞外基质（简称ECM）中获得的。在细胞生长过程中正常细胞只有粘附于一定的基质才能生长，脱离了基质细胞生长就会很快停止于Gl期或G0期。整合素(Integrin)即RGD受体的统称[1]，整合素介导着许多种类的细。细胞及细胞．底物间的相互作用，参与许多生物学过程。如体内平衡调节，细胞粘附，细胞迁移，细胞内信号传递过程，淋巴细胞识别，血小板的凝聚等。含RGD序列的粘附蛋白在细胞粘附中起重要作用[2]。药理学实验表明，许多含RGD序列的小分子片段可抑制细胞的粘附。许多病理学过程如血栓形成，肿瘤组织的转移等都与细胞粘附作用有关。因此RGD类多肽的粘附性成为药物设计的新靶点，含RGD序列的多肽或化合物有望治疗一些与细胞粘附作用相关的疾病。很多线性肽在体外具有较好的生物活性和稳定性，但由于体内存在各种各样的酶，这些酶的存在会破坏活性肽的结构，从而导致其在体内半衰期短，生物利用度低。对于需要大量用药的治疗方案来说，无疑会大大增加医疗费用，并可能导致意想不到的治疗风险。因此，增加肽类化合物的稳定性，提高肽的生物活性和生物利用度是很多药学工作者所努力的方向。除了改变多肽类药物的剂型，从而延长其半衰期，增强其抗酶解能力外，将肽链的主体或部分设计为环形结构，也是增加多肽生物稳定性的有效方法之一，并且有大量的科学实验已证明了这一点。笔者在平时的工作中也遇到过很多含RGD序列的环肽，现对含RGD序列的不同环肽的合成方法在这作一概述。1通过二硫键成环的含RGD序列的环肽由于Cys的侧链-SH易于氧化成S-S键，因此可采用此特性将线性肽氧化成环肽。笔者在平时的实验中也遇到很多通过二硫键成环的含RGD序列的环肽，其通式为-X1c(CRGDC)X2-。合成的思路一般是先用固相法合成线性肽树脂，采用缩合剂DIC/HOBt,HBTU/HOBt/NMMM或PyBOp/HOBt/NMM等，然后采用液相氧化。二硫键的形成也可以通过固相氧化如I2,K3Fe(CN)6，空气，Tl(tfa)3等，但固相法氧化中间过程不容易控制，氧化条件难以掌握，所以一般采用液相氧化，可以通过HPLC随时跟踪检测。液相氧化时多肽浓度一般在0.1～0.5mg/ml,可通过空气氧化[4]，将脱保护游离出半胱氨酸-SH的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性(PH6.5～10)，在空气中搅拌自然氧化，时间一般需要24h以上。此法的有点是：副产物为水，纯化方便。缺点是氧化时间长且很难氧化彻底。H2O2氧化因具有副产物为水，氧化迅速，纯化方便等优点，因此是我们用的最多的一种氧化方法。氧化前将粗肽用水溶解完全，可加适量DMSO,醋酸等助溶。用氨水或NaHCO3调pH到7.2～7.4之间，加10～20倍量左右的10％H2O2，反应一般在30min～2h,用HPLC跟踪检测氧化是否完全。氧化完全后用醋酸调PH值到4～5左右，加少量Vc防止过氧化。文献中报道液相中氧化二硫键还可以用20%DMSO水溶液氧化，反应1～4h,可在PH3～8范围内适用，对碱性或疏水性的肽尤其适用。除此之外，还可用I2,K3Fe(CN)6，N-碘代琥珀酰亚胺（NIS)氧化，氰化碘（ICN）,锍盐氧化，Npys氧化法，都有相应的环化实例。2通过酰胺键成环的含RGD序列的环肽关于环肽的合成有很多的文献报道，从成环方式上可分为三种方式[5]：（1）头尾成环脱去N端保护,游离的氨基进攻肽链的C末端。（2）侧链-侧链成环,即侧链的氨基(如Lys,Orn)与侧链的羧基(如Asp,Glu)成环。(3)侧链有羧基的氨基酸与N端成环。从合成方法上又可分为溶液合成法和固相合成法两种[6]，溶液合成法是在高度稀释的溶液中进行的（一般为10-3～10-4mol/L）,将裂解下来的线性肽在缩合剂的加入下成环，也可先将C端活化再成环。C末端活化的方法有活泼酯法，叠氮法，硫酯法或加入辅助试剂成环。固相法成环是在树脂上成环，然后脱落下来，避免了分子间的聚合。据文献报道常用的树脂有MBHA,OXime,PAM等树脂。笔者合成过的含RGD序列的环肽有－X1RGDX2-或-RGDX1X2-等形式。如笔者曾经合成过RGDFK序列的环肽,在G和D之间通过酰胺键成环。线性肽用固相合成法合成，环化用溶液法环化。具体步骤：先用固相法制备DKFRG-CTCResin,再加入TFE:DCM=2:8裂全保护肽，得到NH2-D(OtBu)-K(Boc)-F-R(pbf)-G-OH。此环化所用的缩合剂为PyBOP:HOBt:NMM:全保护肽＝3:3:6:1(为mol比)，称好PyBOP/HOBt溶于DCM中，再将全保护肽溶于DCM中，通过恒压滴液漏斗缓缓滴入缩合试剂中，控制环化时肽浓度在0.5mg/ml左右。环化时间24h,中间可以通过HPLC监测主峰保留时间变化，以此初步判断环化是否完全。此实验中在环化接近24h时，HPLC检测已环化上95％，将DCM旋去，加裂解试剂裂解得到环化后的粗肽，最后分析制备，最终计算环化收率在30％左右。除了上述含RGD类型的环肽外，还有些带侧链修饰的RGD序列。如cyclo(DYKRG),因K侧链含有-NH2,可在其上接各种修饰基团，如FITC,DOTA等。本实验室常采用的通用合成路线是首先用2－CTCResin作为载体，用Fmoc固相合成法合成线性肽树脂，再裂解全保护肽，使用PyBOP/HOBt/NMM或PyAOP/HOBt/NMM，或HATU/HOBt/NMM作为缩合剂进行液相环化，理论上后两种缩合剂活性更高，但价格昂贵，大量合成时不利于降低成本。通过HPLC检测环化过程，最后再旋去DCM，加裂解试剂裂解得到环化初肽，最后通过反相HPLC分析纯化。虽然进行液相环化容易产生二聚物或多聚物，但液相环化是经典的合成方法，此合成路线简单易掌握，有实验证明特别适合环八肽的合成[7]。3通过此click化学反应（叠氮与炔成环）的含RGD序列的环肽一般情况下，短肽（如四肽）的首尾环化很困难。一方面由于分子间容易聚合产生聚合物，另一方面由于处于环化过渡肽的四肽分子环张力很大导致环化失败。有文献报道[8],通过使用1,4－二取代1,2,3-三唑作为环化的桥梁，这些三唑化合物具有类似于肽键的原子取代和电子效应，可以通过Cu+催化使叠氮和炔一步成环。如有人使用这一click化学反应类型成功合成了cyclo-[(L)-Pro-(L)Val-ψ(trizaole)-(L)Pro-(L)Tyr]，收虑达到了70％。在合成过程中对环化条件进行了一系列的摸索，确定此反应的最佳反应条件是：CuBr(0.2eq),DBU(3eq),用甲苯做溶剂，在110℃下加热回流16h。笔者合成过类似的环肽，其肽序为cyclo((2-Propynylamine)-D-G-R-E-G-N3),通过click化学反应成环，合成的思路如下：先用2－CTCResin作为载体，用Fmoc固相合成法合成线性肽2-Propynylamine-D-G-R-E-G-N3，在固相上再使叠氮甘氨酸与炔通过click反应成环。环化反应如下图所示：、N3-G-E-R-G-DNH-CCHNNNGECyclizationNHDRGRESINRESIN笔者对成环的条件我们进行了摸索，条件一：CuBr(0.2eq),DBU（3eq），在110℃下将肽树脂用甲苯加热回流16h。条件二：CuBr(0.2eq),DBU（3eq），用甲苯做溶剂，在50℃下将肽树脂油浴加热反应12h。条件三：CuBr(0.2eq),DBU（3eq），Vc-Na(3eq),用DMF做溶剂，使用肽树脂固相环化12h。条件四：CuBr(1eq),DBU（3eq）,用DCM做溶剂，裂解全保护肽后在DCM中环化3h。经过多次反复实验比较，此含RGD序列的环肽成环最佳反应条件应采用条件四，总收率可达到40%。含RGD序列的环肽及其类似物的环化也可以在溶液中进行。一般方法是先使用2－chlorotritylchlorideResin在为载体，采用Fmoc固相合成法合成线性肽树脂，再裂解得到全保护肽，然后在溶液中环化，使用HPLC跟踪反应进程。随着RGD序列环肽的研究和应用越来越广泛和深入，如何简化工艺路线，得到低消旋，高收率，高生物活性和高稳定性的RGD环肽及其类似物是今后合成研究努力的方向。REFERENCES[1]RUOZG,QIUCL,XIEP.ProgressinthestudyonsynthesisofRGD-containingpeptidomimetics[J].PharmJChinPLA(解放军药学学报),2005,21(2):129-132.[2]YANGDC,YANGY,XIAOQ.ProgressinthestudyonsyntheticmethodofRGD-Containingcyclopeptideanditsanalogues[J].ChineseJOrganicChem(有机化学),2001,16(6):440-443.[3]ZUOZL,ZHOUL,SUY,etal.StudyonthestructrueandactivityrelationshipofthepeptidescontainingRGD[J].WCJ.PS(华西药学杂志),2002,17(2):92-94.[4]WANGLY,PANHP,CHENZY.Methodsofdisulfideformationinpeptidesynthesis[J].ChineseJOrganicChem(有机化学),1998,18(6):576-580.[5]TANGYC,TIANGL,YEYH.Progressinthestudyonsyntheticmethodofcyclopeptides[J].ChemJChineseUniversities(高等学校化学学报)，2000,21(7):1056-1063.[6]SUNXW,DENGHY,TANHY.Analyticmethodandresearchofcyclopeptides[J].R&DofworldSciandTech(世界科技研究与发展),2005,27(4):72-77.[7]YANGY,YANGDC,XIAOQ,etal.ResearchonthesyntheticmethodofRGD-contaningcyclopeptideanditsanalogues[J].ChineseJOrganicChem(有机化学)，2002,22(4):239-247.[8]BOCKVD,PERCIACCANTER,JANSENTP,etal.Clickchemistryasaroutetocyclictetrapeptideanalogues:synthesisofcyclo-[Pro-Val-ψ(trizaole)-(L)Pro-(L)Tyr][J].OrgLett,2006,8(5):919-922.