动物基因组DNA和RNA的提取

动物基因组DNA和RNA的提取原理1、核酸的分类DNA(脱氧核糖核酸)主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA（核糖核酸）存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。核酸的理化性质在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在2、核酸制备的一般原则微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来分离纯化核酸总的原则：2、核酸制备的一般原则核酸纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子(蛋白，脂类，多糖类)的污染。核酸制备时应注意的事项:①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。②减少化学因素对核酸的降解。③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温④防止核酸的生物降解：排除核酸酶。降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。核酸酶的抑制和抑制剂DNase抑制①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。RNase抑制①操作要带手套。②所有器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。常用的RNA酶抑制剂•焦磷酸二乙酯（DEPC）抑制强烈、不彻底•异硫氰酸胍有效抑制、分解核蛋白•氧钒核糖核苷复合物有效抑制•RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）有效抑制•其它：SDS、尿素、硅藻土等有效抑制上述大部分试剂有致癌之嫌，应谨慎操作！核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。去垢剂的作用：1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC核酸制备中常用的蛋白质变性剂核酸制备中常用的酶DNase:降解DNARNase：降解RNA蛋白酶K：降解蛋白质溶菌酶：破碎细胞3.核酸制备的一般步骤：破碎组织细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂2）破碎抽提核酸除去杂质首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离使核酸与蛋白质分离除去脂类多糖的除去3）核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。4）核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4℃样品经常使用-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存,避免反复冻融保存介质：灭菌水TE缓冲溶液(最常用)：10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0一、动物基因组DNA的提取主要方法：(1)浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。1）用1M氯化钠提取,得到的DNP粘液2)与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化3)离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中4)用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来一、动物基因组DNA的提取（2）阴离子去污剂法:用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。一、动物基因组DNA的提取（3）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。DNA的提取：苯酚抽提法1.材料、设备及试剂材料：冷冻或新鲜抗凝全血，组织样设备：EP管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，涡旋振荡器试剂：裂解液lysisbuffer（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇、NaAC＋、RNA酶、无水乙醇、灭菌水1）在500μl抗凝血中加入lysisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。2）沉淀中加入lysisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。3）彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。4）加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。5）每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。2.操作步骤（血样）6）取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇（24：1），摇匀10min，以5500rpm，离心15min。7）取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。8）取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。9）以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。10）加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。3.注意事项——材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集3.注意事项——细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：•植物材料－－液氮研磨•动物组织－－匀浆或液氮研磨•组培细胞－－蛋白酶K•细菌－－溶菌酶破壁高温温浴时，定时轻柔振荡3.注意事项——核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法3.注意事项——核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解•TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase•pH值为8.0，可防止DNA发生酸解①DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质②DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应③DNA中残留有金属离子①重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质②重新沉淀DNA，让酒精充分挥发③增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）4.DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因对策①材料不新鲜或反复冻融②未很好抑制内源核酸酶的活性③提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断④外源核酸酶污染⑤DNA样品反复冻融①尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融②液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液③在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量④细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔⑤所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌⑥将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题二：DNA降解对策原因5.DNA提取常见问题①实验材料不佳或量少②破壁或裂解不充分③沉淀不完全④洗涤时DNA丢失①尽量选用新鲜（幼嫩）的材料②动植物要匀浆研磨充分；细菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁③高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）④低温沉淀，延长沉淀时间⑤加辅助物，促进沉淀⑥洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少对策原因5.DNA提取常见问题•PlasmidDNAExtraction(Midiprep).flv•mRNAExtractionfromTotalRNA.flv1．材料：组织或者细胞2.方法：TRIzol法，试剂盒二.动物基因组总RNA的提取总RNA提取试剂盒亚硫氢胍，巯基乙醇，n-月桂肌氨酸：变性细胞内及核蛋白复合物，释放RNA；有效抑制核酸酶。苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（pH4.7）：酸平衡苯仿可抽提去除杂物。DNA及蛋白沉淀到有机相，RNA留在水相。酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀RNA。用锂沉淀导致小于5.8sRNA的丢失，并不利于下游操作。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，及沉淀RNA。1．TRIzol试剂2．氯仿3．异丙醇4．75%乙醇（DEPC水配制）5．DEPC水TRIzol法提取RNA试剂准备:•操作步骤•TRIzol法（组织）①戴一次性手套将组织样品从液氮中取出，用干灭过的剪刀将样品外包裹用纱布及表层的肉样剪掉，然后放入干灭过的研钵中，往研钵中倒入液氮，快速研磨成细末状；②用1ml一次性塑料吸头挑取细末装入灭过菌的7mL一次性塑料离心管中用电子天平进行称量，每管中称取0.2g样品；③往管中加入2mLTRIZOL，用力振荡后于15-30C温育5min以裂解细胞，再加入0.4mL三氯甲烷并剧烈振荡15s后于15-30C温育3min；④将离心管置于冷冻离心机2-4C10000rpm/min离心15min，小心吸取上清转入另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后于15-30C温育15min以沉淀总RNA；⑤将离心管置于冷冻离心机2-8C10000rpm/min离心15min，弃上清；⑥加入2mL用冰预冷的75%乙醇漂洗，2-8C7000rpm/min离心5min，弃上清，于室温干燥10min；⑦加入适量DEPC处理水并于55-60C水浴温育10min以溶解总RNA，取适量用于DU640核酸蛋白测定仪测定浓度。余下总RNA样品的水溶液须保存在-80C。•TRIzol法（细胞）①将1mlTrizol加入1-5×105细胞（6孔板）中，室温放置3min。②将全部溶液转移到1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。③4℃离心，12000g×15min，取上清液(约400ul)。④加入0.4ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。⑤4℃离心，120