动物组织核酸的分离鉴定和含量测定

动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定1.猪肝基因组DNA分离2.核酸的定量和纯度测定3.脱氧核糖的显色实验核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内，是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式--核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等现象起着重要的决定作用核酸分为两大类--核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定DNA和RNA的结构基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。1.猪肝基因组DNA的分离核酸分离的原则在溶解细胞的基础上，利用有机溶剂抽提蛋白质（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀核酸，收获核酸分离的一般步骤1溶解细胞溶解细胞的方法因样品不同而不同，如十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS）加EDTA法、蛋白酶消化法、强碱法、超声破碎加冻融等。2有机溶剂抽提苯酚使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的。3纯化为了得到纯的核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去RNA，得到纯的DNA；用DNA酶除去DNA，得到纯的RNA。4沉淀为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸，再通过离心回收核酸，然后用70%-80%乙醇洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。核酸分离试剂盒:可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或RNA，其分离原理是在特定溶液环境下（高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质（一般是硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中，以达到分离、回收核酸的目的。盐溶法分离DNA和RNA的原理根据RNA与DNA在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离：在0.14M的氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解度大，而DNA核蛋白溶解度小；相反在1M的氯化钠溶液中，DNA核蛋白的溶解度大，而RNA核蛋白的溶解度小，从而使DNA和RNA核蛋白分开。然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离DNA和RNA的目的。酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提酚：有效的使蛋白质变性，不能完全抑制RNA酶的活性，能溶解带有长poly(A)的RNA分子。使用前必须用水饱和并用Tris平衡至pH7.8，以防止DNA分配到有机相。氯仿：强烈的脂溶性，去除脂类杂质，增加有机相比重。纯酚的比重为1.07，有机相和水相有时很难分开。加入氯仿（比重为1.47）可以避免这一问题。同时，酚有时会微溶于水，可以用氯仿将水相中的酚去除。异戊醇：降低表面张力，减少气泡产生，使离心后的水相、变性蛋白相及有机溶剂相维持稳定。实验步骤1.2g挤干乙醇后加1mlSC液溶解2.核酸的定量和纯度测定•紫外分光光度法:定量：260nm下，1OD相当于50ug/ml双螺旋DNA，40ug/ml双链RNA检测纯度：纯的DNAA260/A280=1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时，A260/A280比值降低。•定糖法:DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法•定磷法:测定核酸的磷酸部分实验方法•1mlSC溶液溶解DNA，8000rpm离心5分钟后，将上清转移到5ml离心管中，用1ml0.01MNaOH溶液加入沉淀中，使其充分溶解，并再次离心5分钟，上清与第一次溶解液合并备用•A260测定：以SC溶液作为空白，取上清测A260值（OD3.0即在测量范围之内），并计算DNA浓度（1OD=50mg/mlDNA）•A280测定：A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中混有蛋白质，则比值小于1.8•若A260/A280比值较为正常，则可确定二苯胺法测量DNA浓度的粗略稀释倍数，使A260值在2.0左右（DNA浓度约为100ug/ml）3.脱氧核糖的显色实验加热条件下：RNA＋浓盐酸＋地衣酚绿色DNA＋酸＋二苯胺蓝紫色二苯胺显色法原理DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成w-羟基-g-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在40~400mg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。DNA标准曲线的制作和样品测定试剂（ml）管号012345样品1样品2DNA标准溶液（200mg/ml）0.00.40.81.21.62.02.02.0H2O2.01.61.20.80.4000二苯胺试剂4.04.04.04.04.04.04.04.060℃水浴中保温1h，冷却测OD595注：待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液二苯胺法的测定范围是40-400ug/mlDNA，浓度太小会影响测定结果以DNA的含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。DNA含量计算根据标准曲线,以样品的光密度计算出相应DNA含量,并同紫外法测定的值进行比较，分析二者差异的原因。注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外面一定要擦干净。实验报告要求•实验结果以研究论文形式提交电子版本•包括摘要、前言、实验材料和实验方法、实验结果和分析、讨论和参考文献