动物细胞培养与细胞生死状态的鉴别

动物细胞培养与细胞生死状态的鉴别（台盼蓝染色法）生命科学学院临床医学七年制二班桑文涛201300231113实验目的1学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。2了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。3熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。4学习细胞生死状态鉴别的方法。5了解细胞生死状态鉴别的原理。6熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。7掌握细胞技术方法，计算细胞存活率。实验原理细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。实验用品1.超净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、酒精灯；小鼠、培养基2.血球计数板、盖玻片、滴管、显微镜；培养的小鼠脾脏细胞、台盼蓝实验步骤1、取材取小白鼠一只，采用断头法处死：清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟。取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1—2次。转入无菌玻璃培养皿，待用。2、分离脾细胞用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1—2分钟。吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000r/分离1—2分钟。3、培养脾细胞超净工作台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净工作台内开盖弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培养液400μl加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200μl脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。4、台盼蓝法鉴定细胞的生死状态：（1）试剂配制：用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。(已提前备好)（2）细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，静置3-5min，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。（已提前备好）（3）染色制片：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。（4）染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。或者（3）染色计数：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。在普通光镜10´物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右。（4）根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：细胞存活率=（细胞总数-死亡细胞数）/细胞总数*100%注意事项1在进行方格查数时注意：数上不数下，数下不数上。2实验涉及的台盼蓝染料有致癌危险，因此滴加染液时要小心，防止溅到皮肤上。3动物细胞培养使用的所有器皿、用具、溶液等必须经过严格消毒或除菌处理，才能进超净工作台中使用，整个实验过程都要有无菌操作的概念，避免细胞被污染。4在超净工作台内点燃酒精灯后，实验操作应在火焰的附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼后要待其冷却才能夹取组织，经过培养液的用具不能长时间烧灼，以免烧焦形成碳膜。5超净工作台内吸取溶液用的的各种吸管等不能混用，以免相互污染。6在超净工作台中，组织细胞、培养液等不能敞开暴露过久，以免溶液蒸发和pH变化。7器皿、离心管培养瓶等在离开超净工作台前必须将盖子或橡皮塞盖紧，以防止细胞污染或溶液漏出。实验结果（取材于自组培养的细胞）项目左上左下右上右下中间总细胞142127818死细胞7102238计算：细胞总数：14+21+27+8+18=88死细胞总数：7+10+22+3+8=50细胞存活率=（细胞总数-死亡细胞总数）/细胞总数X100%存活率=（88-50）/88×100%=43.18%每毫升液体中细胞的数=（14+21+27+8+18）X5X10000=440000细胞培养结果实验结果分析1活细胞边缘较明显，而求细胞膜维持正常的选择透过性，染料无法通过，所以呈现透明无色2死细胞由于细胞膜不再具有生物活性，染料从细胞膜通过，将细胞染色，且死细胞的边缘不明显。3将培养基刚从培养箱拿出来时，培养基的颜色应呈现无色（由于细胞的代谢产物为酸性以及培养箱中的二氧化碳浓度较高），过一段时间后渐渐恢复粉红色。4用倒置显微镜观察时，可以看到在黄色的背景下有一些透明的细胞。附：1.抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物；2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物；3）应用结晶紫染色测定法筛选抗肿瘤药物；4）应用噬菌体筛选抗肿瘤药物；5）细胞水平和动物水平相结合筛选具有抗肿瘤作用的中药。2.诱导肿瘤细胞发生凋亡的药物的筛选方法利用单克隆抗体进行筛选3.细胞的冻存、复苏、运输方法细胞冻存：（1）液氮法（2）分布降温法（深低温冰箱法）（3）玻璃化法细胞复苏：1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；3.离心，1000rpm，5min；4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；5.次日更换一次培养液，继续培养。细胞运输：1、冷冻贮存运输：即利用特殊内内盛液氮或干冰冻存，保存效果较好，但较麻烦，且不能长时间运输，多需空运。2、充液法：（1）、选生长状态良好的细胞，去掉培养液，充满新培养液，液量要达到培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞以胶塞，保留微量空气。若空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。（2）、妥善包装、运输。一般在四五天内到达目的地，对细胞活力无多大影响，时间过长则细胞活力下降。（3）、到达目的地后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液量，置37℃培养,次日传代。