动物肝脏DNA的制备DNA的Tm值测定

动物肝脏DNA的制备、DNA的Tm值测定Ⅰ动物肝脏DNA的制备一、目的1．了解肝脏组织制备核酸DNA的方法；2.弄清DNA制备的过程中，清除RNA和蛋白质的机理。二、原理1.根据核糖蛋白（RNP）和脱氧核糖蛋白（DNP）在一定浓度电解溶液中溶解度不同，将二者分离。然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，并释放出DNA，再利用核酸不溶于乙醇的性质将其析出，达到分离提纯DNA的目的。2.在0.14mol/L的氯化钠溶液中，RNP溶解度大，而DNP的溶解度却很小；相反，在1mol/L的氯化钠溶液中，DNP的溶解度却很大，从而使二者获得了分离。核蛋白分离后可用蛋白质变性沉淀剂（氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠和热酚）去除蛋白质，释放出的DNA用乙醇沉淀，析出核酸。3.动物肝脏中含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶，因此在提取核酸时，尽量在低温下操作，并要加柠檬酸钠作为金属离子的络合剂。防止Mg2+、Fe2+及Co2+等激活剂，以便降低核酸酶对核酸的水解作用。三、操作1抽提取新鲜鸡肝2g，用SC液洗去血液，低温剪碎（在预冷的研钵中操作），加入4mlSC缓冲液,用玻璃匀浆器匀浆，然后离心(4000r/min)10min,倾出上层RNP层溶液。向下层溶液中再加入4mlSC缓冲液，震荡混匀后再4000r/min离心10分钟。倒掉上层溶液。2分离将下层沉淀用10mlSC液冲洗并转入50ml三角锥形瓶中混匀后，加入2ml5%SDS溶液，混匀，再加入7.5ml氯仿/异戊醇，边振动边加入1.15gNaCL晶体，充分混匀后振荡30min，然后转入到50ml离心管，于4000r/min离心20min。小心用吸管由上至下吸取上层DNA层溶液于干净小烧杯中。3．提纯加入2倍DNA溶液体积的95%的乙醇，边加入边用玻璃棒沿同个方向缓慢搅动，当成纤维状DNA全部绕在玻璃棒取出，再用95%乙醇2ml冲洗干净，再用5%氨水将其溶解。并用蒸馏水定容到5ml。即为样品溶液。待测样品编号，放置在冰箱中。四、思考题1、在核酸提取溶液中，当加入一定浓度SDS、异戊醇和氯仿后，得到三层溶液分别含有哪些主要物质，为什么？2、SC缓冲液的组成分是什么，该溶液在制备核酸时有何作用，能否用磷酸盐缓冲液代替？3、如何用紫外法判断DNA样品的纯度？Ⅱ酵母RNA的提取一、目的1．了解用浓盐法提纯RNA的基本原理和方法。二、原理1.酵母中RNA含量可占干重3-10%，DNA含量很少。因此采用酵母作为制备RNA的原材料。2.适宜于RNA制备的方法有稀碱法、浓盐法和苯酚法。前者是用1%NaOH溶蛋白质层氯仿层水相液，将细胞壁溶解，用酸中和。本实验采用浓盐法提取RNA，其机理是用10%NaCL溶液改变细胞膜的通透性，使核酸从细胞内释放出来，然后升高温度使蛋白质变性，将蛋白质与核酸分离，除去菌体，再调至pH2.5(RNA的等电点)，使RNA沉淀出来。三、操作1、提取称取干酵母粉2g于50mL三角瓶内。加10%NaCl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸水浴中提取半小时。2.分离将上述提取液取出，用自来水冷却，分装在离心管内，以3500r/min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。3.沉淀RNA将离心得到的上清液倾于50mL烧杯内，并置于有冰块的250mL烧杯中冷却。待溶液冷至10℃以下时，在搅拌下小心地加入等体积的酸性乙醇，随着酸性乙醇的加入，溶液的pH逐步下降，溶液中白色沉淀也逐渐增加，当pH=2.5（RNA等电点）时沉淀量最多（注意严格控制pH值），继续于冰浴中静置10min，使沉淀充分，颗粒变大。3.冼涤、溶解将RNA沉淀液离心（3000r/min）5min，去上清，收集沉淀，加入3mL0.5mol/L碳酸氢钠溶液溶解沉淀（用玻捧缓慢搅拌沉淀，以助溶解，如有不溶物则为杂质，再离心去除之）。得到RNA制品溶液，供测定之用。如需要进一步纯化时，可在冷却下，加入两倍冷乙醇进行沉淀。将沉淀物置10ml量筒里，用少量蒸馏水将沉淀物调成糊状，经充分膨胀后，再加少量蒸馏水稀释，然后用6%氨水调pH至7.0，并暂且定容到5ml，测定稀释50倍后的A260应控制在0.6-1.0之间，根据该测定值再次调节待测样品的体积，作为待测样品。待测样品编号，放置在冰箱中。数据处理：0.911.11.21.31.43035404550556065707580859095100105温度（℃）A260(t)/A260(25℃)管号12340.1%淀粉溶液（ml）1.51.51.51.5稀释唾液（ml）0.50.50.50.51%硫酸铜溶液（ml）0.51%氯化钠溶液（ml）0.51%硫酸钠溶液（ml）0.5蒸馏水（ml）0.5室温保温10min碘化钾-碘溶液（ml）2222现象管号123456789101112温度（℃）375060707580859095100100-50100-37保温15minA260nm0.4870.50.5040.510.5140.5440.5780.5960.6120.5710.5530.492At/A260nm11.0271.0351.0471.0551.1171.1871.2241.2571.172