内源性一氧化氮与硫化氢在大鼠低氧性肺动脉高压中的相互作用

北京大学学报（医学版）·52·JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY（HEALTHSCIENCES）Voi.36No.1Feb.2004·论著·内源性一氧化氮与硫化氢在大鼠低氧性肺动脉高压中的相互作用张清友1，杜军保1，石琳1，张春雨1，闫辉1，唐朝枢2（北京大学第一医院1.儿科，2.心血管病研究所，北京100034）［关键词］一氧化氮；硫化氢；低氧；肺动脉高压［摘要］目的：研究一氧化氮（nitricoxide，NO）/一氧化氮合酶（nitricoxygnase，NOS）体系和硫化氢（hydrogensui-fide，H2S）/胱硫醚!-裂解酶（cystathionine-!-iyase，CSE）体系在低氧性肺动脉高压发生机制中的作用及其相互关系。方法：将25只大鼠随机分为4组：低氧组（7只）、低氧+!-NAME组（给与NOS抑制剂N-硝基-!-精氨酸甲酯处理的低氧组，6只）、低氧+PPG组（给与CSE抑制剂炔丙基甘氨酸处理的低氧组，6只）和对照组（6只）。低氧21d后，测定肺动脉平均压、血浆NO及H2S含量，分别测定低氧组、低氧+!-NAME组及对照组CSE活性，应用免疫组织化学的方法检测低氧组、低氧+PPG组及对照组的肺动脉内皮细胞eNOS表达。结果：低氧21d大鼠肺动脉平均压力明显增高，同时血浆中NO和H2S含量、肺动脉内皮细胞eNOS表达及肺组织CSE活性亦明显下降；而低氧+!-NAME组，伴随着NO含量的下降，肺动脉平均压显著上升，同时，血浆中的H2S含量及肺组织CSE活性较低氧组显著上升；在低氧+PPG组，伴随血浆H2S含量的降低，肺动脉压力显著升高，同时血浆中的NO含量及肺血管内皮细胞eNOS表达也较低氧组显著上升。结论：内源性NO/NOS体系与H2S/CSE体系在低氧性肺动脉高压中呈现相互的负性调节作用。它们既相互独立又以网络调节的方式共同参与低氧性肺动脉高压形成的调控机制。［中图分类号］R331［文献标识码］A［文章编号］1671-167X（2004）01-0052-05InteractionbetweenendogenousnitricoxideandhydrogensulfideinpathogenesisofhypoxicpulmonaryhypertensionZHANGOing-you1，DUJun-bao1，SHILin1，ZHANGChun-yu1，YANHui1，TANGChao-shu2（1.DepartmentofPediatrics，2.InstituteofCardiovascuiarResearch，PekingUniversityFirstHospitai，Beijing100034，China）Nitricoxide；Hydrogensuifide；Hypoxic；PuimonaryhypertensionSUMMARYObjective：Toinvestigatetheinteractionbetweennitric（NO）/nitricoxygenase（NOS）andhydrogensuifide（H2S）/cystathionine-!-iyase（CSE）systeminthepathogenesisofhypoxicpuimo-naryhypertension.Methods：25ratswererandomiydividedintofourgroups：hypoxicgroup（=7），hypoxic+!-NAMEgroup（=6），hypoxic+PPGgroup（=6）andcontroigroup（=6）.After21days，puimonaryaterymeanpressure（mPAP）ofeachratwasevaiuated，andthepiasmaconcentrationofH2SandNOwasmeasured.Meanwhiie，theactivitiesofCSEinpuimonarytissueinhypoxic，hypoxic+!-NAMEandcontroigroupsweredetected，respectiveiy，andexpressionsofNOSinpuimonaryarteriesinhypoxic，hypoxic+PPGandcontroigroupswereaisodetectedbyimmunohistochemistrytechnigue.Results：mPAPwassignificantiyincreasedinhypoxicratsascomparedwithnormaicontrois.Meanwhiie，comparedwithcontrois，theproductionofNOandH2Sinpiasma，theactivityofCSEinpuimonarytissueandexpressionofNOSinpuimonaryarteriesweremarkediydecreasedinhypoxicrats.However，mPAPwassignificantiyincreasedinhyopxic+!-NAMEgroupascomparedwithhypoxicgroups，andatthesametime，thepiasmaconcentrationofNOwasmarkediydecreased.However，thepiasmaconcentrationofH2SandtheactivityofCSEinpuimonarytissueinhyopxic+!-NAMEgroupwereincreasedsignifi-cantiyascomparedwiththoseofhypoxicgroup.PPGaisoworsenedpuimonaryhypertensionofhypoxicrats，however，itincreasedendogenousproductionofNOandtheexpressionofNOSofpuimonaryarteriesobviousiy.Conclusion：ThereisanegativefeedbackeffectbetweenNO/NOSsystemandH2S/CSEsys-temindeveiopmentofhypoxicpuimonaryhypertension.Theymightinteractwitheachotherandthere-基金项目：教育部博士学科点专项科研基金（20020001063）、国家重大基础研究发展规划项目基金（G2000056905）和国家自然科学基金（30271373）资助SupportedbytheDoctorateTrainingProgramFoundationoftheMinistryofEducationofChina（20020001063），theMajorStateBasicReseachDeveiopmentProgramofPeopie’sRepubiicofChina（G2000056905）andtheNationaiNaturaiSciencesFoundationofChina（30271373）ACorrespondingauthoremaii，[e-mail]张清友，等内源性一氧化氮与硫化氢在大鼠低氧性肺动脉高压中的相互作用·53·foreplayanimportantregulatingroleinhypoxicpulmonaryhypertension.（PekingUniu［HealthSci］，2004，36：52-56）低氧性肺动脉高压是临床众多心、肺疾病发生、发展过程中重要的病理生理环节，阐明其发病机制［1］是当今该领域亟待解决的重要课题。内源性气体信号分子一氧化氮（nitricoxide，NO）和一氧化碳（carbonmonoxide，CO）的发现，将低氧性肺动脉高压的发病机制研究带入了一个全新阶段。而最近发现人体内含硫氨基酸代谢产物，过去一直被认为是毒性气体的硫化氢（hydrogensulfide，H2S）具有重要的生物学功能。人们推测H2S可能是在NO和CO［2］之外机体的第3种气体信号分子。我们课题组近［3］期的研究发现，内源性H2S体系的下调也是低氧性肺动脉高压及肺血管结构重构的重要机制之一。NO和H2S都是小分子气体，能自由通过各种生物膜，并具有持续产生、传播迅速、弥散性强和作用广泛的特点，而二者又主要分别来自内皮细胞和平滑肌细胞等不同类型的细胞，在病生理状态下发挥着重要的生物学功能。那么心肺血管系统是否存在由NO与H2S构成的信号调节网络？基于以上问题，我们将内源性NOS抑制剂N!-硝基-L-精氨酸甲酯（N!-nitro-L-argininemethylester，L-NAME）及CSE［4］的抑制剂炔丙基甘氨酸（Propargylglycine，PPG）应用于慢性低氧大鼠，观察了肺循环的H2S/CSE系统和NO/NOS系统的变化，来探讨两系统在低氧性肺动脉高压发生机制中的作用及其意义。1材料与方法1.1低氧肺动脉高压大鼠动物模型复制及实验分组选取体重180~200g的健康雄性Wistar大鼠25只，随机分为：对照组（n=6），低氧组（n=7），低氧+L-NAME组（n=6）和低氧+PPG组（n=6）。将低氧组和低氧+L-NAME组大鼠置于常压低氧舱内［含10%（体积分数）O2，90%（体积分数）N2］，每天连续低氧6h，共21d。对低氧+L-NAME组大鼠每天低氧前腹腔注射L-NAME（5mg/kg，每次使用前新鲜配制）；低氧+PPG组大鼠按文献［4］所述每天低氧前腹腔注射PPG（30mg/kg）。低氧组及对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。各组大鼠饮食及饮水条件相同。1.2血流动力学测定及标本制备低氧实验结束后（第22天），给大鼠腹腔注射120g/L乌拉坦10mL/kg体重麻醉，用右心导管法测定肺动脉平均压（mPAP），颈动脉插管测定体循环平均压（mAP）。从肺动脉中取血5mL，置于肝素抗凝管中，离心后取血浆检测H2S含量或/和NO含量。打开胸腔取一侧肺叶以10%（体积分数）甲醛溶液固定，梯度乙醇顺序脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片（厚5m），用于免疫组织化学分析。取另一侧肺叶经液氮迅速冷冻后-70C保存，制备肺组织匀浆。1.3血浆NO含量的间接测定硝酸还原酶测定法。因NO化学性质活泼，半衰期极短，迅速与分子氧反应生成NO2-和NO3-，故以血浆或肺组织匀浆NO2-和NO3-之和检测NO的相对含量，应用Bioting-tech公司提供的NO测定试剂盒，采用硝酸还原酶特异性地将NO3-还原为NO2-，NO2-与显色剂亚乙烯二胺作用，生成粉红色偶氮化合物，通过比色测出NO2-/NO3-含量。1.4血浆中H2S含量测定［3］采用去蛋白的方法。首先在试管中加入10g/L醋酸锌0.5mL，然后加入0.1mL血浆标本，振荡混匀，使血浆中的硫离子与醋酸锌充分反应形成硫化锌沉淀而固定下来；再依次加入20mmol/L对苯二胺盐酸盐0.5mL和30mmol/L三氯化铁0.5mL，室温孵育20min使之充分显色。再加入10%（体积分数）三氯醋酸1mL使蛋白沉淀下来，加2.5mL蒸馏水补足体积至5mL。6000r/min离心5min，吸出上清液，用分光光度计在波长670nm处检测上清液的吸光度。根据H2S标准曲线计算上清液中H2S的含量。1.5肺组织CSE活性测定参照文献［5］方法测定对照组、低氧组及低氧+L-NAME组的肺组织CSE活性。取大鼠肺组织在冰冷的50mmol/LpH6.8的磷酸钾缓冲液中研磨成匀浆。反应在25mL锥形瓶中进行，反应体积1mL，含100mmol/LpH7.4的磷酸钾缓冲液、10mmol/LL-半胱氨酸、2mmol/L5*-磷酸吡哆醛和10g/L的组织匀浆。在中央室中加入10g/L