化疗对乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群及CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的影响

化疗对乳腺癌患者外周血淋巴细胞亚群及CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的影响康文喜樊静河北省秦皇岛市第四医院邮编：066001摘要：目的探讨化疗对乳腺癌患者外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞及T、B、NK淋巴细胞亚群的动态变化及其临床意义。方法采用流式细胞仪术分析129例乳腺癌患者CD4+CD25+CD127-调节性T细胞水平及CD3、CD4、CD8、NK、B细胞和CD4/CD8比值的动态变化，并进行化疗前后、组织类型和TNM分期的对比分析。结果化疗后乳腺癌患者CD4+CD25+CD127-调节性T细胞比率降低，CD3、CD4、CD4/CD8值增高，CD8、NK和B细胞亚群降低；调节性T细胞的数量与临床分期和组织分化程度有关。结论乳腺癌患者化疗后的免疫调节抑制功能下降，免疫功能得到提高，但体液免疫及NK功能未见提高。关键词乳腺癌化疗CD4+CD25+CD127-调节性T细胞流式细胞术目前化疗是乳腺癌的主要治疗手段，也是规范化治疗的重要组成部分。由于化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会损害正常细胞包括免疫细胞，从而影响患者的免疫功能。CD4+CD25+调节性T细胞（Tregulatorycell，Treg）是体内重要的抑制性免疫调节T细胞，正常情况下主要参与维持免疫稳定，抑制自身免疫疾病的发生；在肿瘤免疫耐受机制中发挥关键的作用[1]。本文通过检测乳腺癌患者化疗前后外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞及T淋巴细胞各亚群变化，分析化疗对机体免疫功能的影响，探讨Treg与肿瘤及临床转归的关联性,为乳腺癌的治疗提供新的理论依据。1.1研究对象本组129例均为我院2009年2月-2010年12月经病理确诊的手术后乳腺癌患者，年龄27~65岁，平均年龄（41.23±6.71）岁，无自身免疫疾病，治疗前未使用过任何免疫调节剂和免疫抑制剂等影响免疫功能的药物。1.2主要试剂及仪器流式细胞仪—EPICSXL为美国BECKMANCOULTER公司产品。CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE、CD19-FITC、CD16-FITC、CD56-PE、CD3-PC5、CD4-PC5、CD25-FITCCD127-PE荧光标记单克隆抗体、同型对照IgG1或IgG2荧光抗体、红细胞裂解液等试剂均为美国贝克曼库尔特（BECKMANCOULTER）公司出品。1.3实验方法所有观察对象均于化疗前1天，化后1周清晨空腹抽取静脉血2ml，EDTA-2K抗凝，使用直接免疫荧光标记法标记细胞并进行流式细胞仪分析。操作步骤：取不同荧光标记的单克隆抗体各20μl分别加入100μlEDTA-2K抗凝的外周血，室温下孵育15分钟，再加入红细胞裂解液孵育10分钟，离心1500转/5分钟，加入PBS2ml洗两次，弃上清后加入适量的PBS，混匀后上机检测。1.4.化疗药物：采用紫杉类+蒽环类联合化疗。1.4统计学处理实验结果应用SPSS13.0统计分析软件，采用t检验进行统计学分析，统计学差异确定为p＜0.05。2.结果2.1乳腺癌患者化疗前后CD4+CD25+CD127-/CD4+T比率变化（见表1）：化疗前患者调节性T细胞比率为4.65±1.38,化疗后调节性T细胞为2.43±1.06，检测结果显示化疗后调节性T细胞水平较化疗前明显降低，差异具有统计学意义。表1.化疗前后调节性T细胞比率变化2.2乳腺癌患者化疗前后淋巴细胞亚群数值的变化（见表2）：表2显示，CD3、CD4、CD4/CD8化疗后较化疗前测定结果均增高，CD8、CD16/56、CD19化疗后较化疗前均降低。分析对象nCD4+CD25+CD127-/CD4+T%化疗前患者化疗后患者1291294.65±1.382.43±1.06P值＜0.01表2129例乳腺癌患者治疗前后淋巴细胞亚群的比较2.3乳腺癌中CD4+CD25+CD127-/CD4+T比率在不同组织学类型的变化（见表3）:结果显示，恶性程度高的浸润性导管癌CD4+CD25+CD127-/CD4+%比率明显高于恶性程度低的管内癌（见表3）。表3乳腺癌不同组织学类型Treg数值的比较2.4乳腺癌在不同TNM分期中CD4+CD25+CD127-/CD4+%比率变化Ⅳ期明显高于Ⅰ-Ⅱ期（见表4）。表4乳腺癌不同TNM分期中Treg数值的比较3.讨论乳腺癌是严重影响妇女身心健康甚至危及生命的常见恶性肿瘤之一,占我国各种恶性肿瘤的7%～10%[2]。研究表明肿瘤的发生与进展是肿瘤细胞逃避免疫监视的结果,肿瘤通过释放和诱导免疫抑制因子如IL-10、TGF-β、IDO等；诱导抑制性免疫细胞如调节性T细胞（Treg）、抑制性抗原呈递细胞、抑制性组别nCD4CD8CD3CD4/CD8CD16+56CD19化疗前12936.5±4.929.5±9.065.9.±7.81.20±0.3313.9±7.68.1±5.6化疗后12940.9±4.927.5±9.279.6±7.81.44±0.6310.6±6.77.0±4.8P值＜0.01＜0.05＜0.05＜0.01＜0.01＜0.05组织类型CD4+CD25+CD127-/CD4+T%浸润性导管癌髓样癌管内癌4.21±1.233.87±0.852.53±1.47P值＜0.01TNM分期CD4+CD25+CD127-/CD4+T%Ⅰ-ⅡⅢⅣ3.45±0.834.56±1.655.82±1.74P值＜0.01CD4和CD8细胞等；抑制免疫细胞活化和效应机制，如抑制CD28和HLA等分子表达，抑制r-干扰素等效应分子表达和作用等。因此，免疫学机制在肿瘤发生与发展及抗肿瘤中都具有十分重要的作用[3-8]。细胞免疫在肿瘤免疫中起关键作用，而T淋巴细胞是细胞免疫的主要组成部分，具有多样化的T淋巴细胞与功能亚群成份在免疫网络调控中发挥重要功能。根据T淋巴细胞表面分化抗原(Clusterofdifferentiation,CD)分子的不同,可将T细胞划分为Th细胞(CD3+CD4+)和Ts细胞(CD3+CD8+)。Th细胞不仅可以分泌大量的细胞因子和辅助Ts细胞杀伤肿瘤细胞,而且具有免疫记忆和直接杀伤肿瘤细胞的功能。Ts细胞是效应阶段的免疫细胞,通过释放效应分子如穿孔素、颗粒酶、r-干扰素或促使细胞凋亡等机制杀伤靶细胞（如肿瘤细胞）。NK细胞是非抗原依赖性免疫效应细胞,它不经致敏可直接杀伤敏感的肿瘤细胞。主要表面标志是CD16和CD56,CD16表达于未成熟NK细胞表面,CD56则在成熟NK细胞表面。这些免疫细胞形成了细胞免疫包括肿瘤免疫的物质基础，因此，其数量和功能的改变将影响肿瘤免疫的发挥。本研究显示:乳腺癌患者外周血总T细胞（CD3）、Th细胞(CD3+CD4+)和CD4/CD8比值在化疗后均高于化疗前，提示化疗明显改变了体内的免疫状态，而Th细胞增高提示化疗后肿瘤负荷减少，能一定程度恢复细胞免疫调控能力。一定比例的病人CD8细胞和NK细胞低于治疗前，提示化疗后免疫细胞亚群乃至功能有再分布，其免疫学和临床意义有待于更深入研究。在诸多的肿瘤免疫逃避相关机制中，调节性T细胞诱导增高和作用增强是最重要因素之一。CD4+CD25+Treg是一类具有独特免疫调节功能的T淋巴细胞亚群[3]，于1995年首次分离成功，是CD4+T细胞的一个重要亚群[9-12]。近年来的研究表明，许多肿瘤有Treg诱导增高现象。本研究显示，乳腺癌患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞也有明显增高现象，其增高程度与文献报道结果一致。本研究还发现，在乳腺癌不同组织学类型中，Treg调节性T细胞的表达亦有所不同，在乳腺浸润性导管癌，CD4+CD25+CD127-调节性T细为4.21±1.23，而在乳腺管内癌CD4+CD25+CD127-调节性T细胞为2.53±1.47。两者相比，恶性程度高者其CD4+CD25+CD127-调节性T细胞水平明显高于恶性程度低的管内癌。在乳腺癌不同TNM分期中，CD4+CD25+CD127-调节性T细胞的数值亦有不同：Ⅰ-Ⅱ期Treg调节性T细胞的数值为3.45±0.83，Ⅲ期Treg调节性T细胞的数值为4.56±1.65，Ⅳ期Treg调节性T细胞的数值为5.82±1.74。结果显示Treg调节性T细胞的数值与TNM分期成正相关，与转移及预后呈负相关。乳腺癌的恶性程度与Treg细胞数目之间存在着密切关系。引起Treg细胞数目增高可能的机制是，肿瘤细胞和肿瘤浸润，刺激周围的巨噬细胞释放CCR4和H-铁蛋白，导致肿瘤微环境中CCR4+天然Treg细胞数目增高。CCR4+天然Treg与PGE2的致耐受的DC接触后，外周血中天然Treg转化为记忆性Treg，导致外周血中Treg细胞数目增高。当Treg细胞增高后，联合致耐受的DC，从而抑制效应T细胞的产生，导致机体抗肿瘤耐受［13］。化疗对Treg调节性T细胞的表达有显著影响，129例中化疗前患者CD4+CD25+CD127-Treg调节性T细胞的表达为4.6±1.4，化疗后患者Treg调节性T细胞的表达为3.4±1.3，P值＜0.01。上述结果提示，Treg细胞诱导增高也是乳腺癌诱导免疫耐受的机制之一，而动态观察乳腺癌患者外周血CD4+CD25+Treg细胞水平，能一定程度预测肿瘤免疫耐受作用。同样，通过各种治疗手段下调CD4+CD25+Treg比例和抑制其作用将有利于机体肿瘤免疫功能的发挥，或许是一种有效地治疗乳腺癌的新方法。总之,化疗对肿瘤患者细胞免疫状态能产生实际性影响，主要是提高了Th细胞的作用，但其免疫学和临床意义有待于进一步研究。乳腺癌患者同样有调节性T细胞的诱导增高，表明Treg也是乳腺癌诱导免疫耐受的机制之一。4.参考文献1.StephensLA,BarclayAN,MasonD.PhenotypiccharacterizationofregulatoryCD4+CD25+Tcellsinrats[J].IntImmunol,2004,16(2):365-375.2.吴在德,吴肇汉.外科学[M].6版.北京:人民卫生出版社,2005:328-329.3.Liu,VC,Wong,LY,Jang,T,Shah,A.H,Park,I,Yang,X.M,Zhang,Q,etal,TumorEvasionoftheImmuneSystembyConvertingCD4+CD25–TCellsintoCD4+CD25+TRegulatoryCells:RoleofTumor-DerivedTGF-β.TheJournalofImmunology.2007.178:2883-28924.RoncaroloMG,GregoriS,BattagliaM,BacchettaR,FleischhauerK,LevingsMK，Interleukin-10-secretingtype1regulatoryTcellsinrodentsandhumans.[J]ImmunolRev.2006.212:28–505.Liu,CH,Chang,SH,Narko,K,Trifan,OC,Wu,MT,SmithE,HaudenschildC,etal,Overexpressionofcyclooxygenase-2issufficienttoinducetumorigenesisintransgenicmice.[J]Biol.Chem.2001.276:18563-185696.CoombesJL,SiddiquiKR,Arancibia-CárcamoCV,HallJ,SunCM,BelkaidY,PowrieFA,AfunctionallyspecializedpopulationofmucosalCD103+DCsinducesFoxp3+regulatoryTcellsviaaTGF-andretinoicaciddependentmechanism.[J]ExpMed.2007.204:1757–17647.HoriS,NomuraT&Sakaguchi