冻融周期移植不同时间囊胚的新生儿结局比较

201606冻融周期移植不同时间囊胚的新生儿结局比较王雪，甄璟然，孙正怡，郁琦，邓成艳，周远征，王含必，何方方（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院妇产科生殖中心北京100730）【摘要】目的：比较D5和D6的冻融囊胚移植后的新生儿结局&进一步为复苏囊胚的选择提供指导。方法：回顾性分析2005年1月至2012年12月在北京协和医院辅助生育中心进行复苏囊胚移植并已分娩的515例患者资料。按照冷冻前形成囊胚的时间D5或D6进行分组，比较两组的新生儿出生结局；并根据分娩胎数将患者分为单胎组和双胎组，分别比较单胎组和双胎组的新生儿结局。结果（1）单胎组：D5组的孕龄、出生体重和出生身长分别为（266.5±14.5）d、（300387.4±584.8）g和（50.1±2.7）cm，与D6组[分别为（268.5±12.6）d、（3379.7±540.8）g和（50.1±2.1）cm]相比均无统计学差异（P0.05）;D5组男女性别比略高于D6组（1.21vs1.08），但无统计学差异（P0.05）。（2）双胎组：D5组新生儿的出生体重[(2531.0±505.4)g]略低于D6组[(2601.8±503.0)g];D5组的低体重新生儿发生率（42.3%）高于D6组（31.4%），但无统计学差异（P0.05）；D5组的男女性别比（1.20）高于D6组（0.92），但无统计学差异（P0.05）。结论在单胎组或双胎组，D5与D6的囊胚冻融移植后出生的新生儿孕周、出生体重和体长均无统计学差异，但是呈现出D6组新生儿体重偏大的趋势；D5组的男女性别比高于D6组，但由于例数所限，未出现统计学差异&还有待于进一步研究。【关键词】冻融胚胎移植；囊胚；发育速度；出生结局辅助生育技术已经成为治疗不孕症的重要手段，经典的IVF治疗是将体外受精后第3天（D3）形成的卵裂期胚胎移植入患者宫腔内。近年来随着胚胎体外培养系统的不断完善，囊胚培养得到广泛应用。理论上囊胚移植有很多优点，囊胚经过了一个再筛选的过程，囊胚移植后的种植率更高，从而活产率增加。另外有研究显示，移植囊胚阶段胚胎可以避免多胎妊娠及相关并发症，也可以提高每周期的妊娠率。在人早期胚胎的体外发育过程中，囊胚的发育速度并不一致，多数会在体外受精后第5天（D5）或第6天（D6）形成。目前在评估囊胚质量时，多数采用Gardner评分系统对囊胚进行形态学评价。目前认为囊胚的发育速度也是一个重要参考因素，通常认为囊胚的发育速度越快，发育潜能越高。但目前关于囊胚复苏移植后的临床结局的研究结论并不一致，有报道认为D5囊胚冻融移植后临床妊娠率、种植率和出生率都显著高于D6囊胚，但也有研究发现D5和D6囊胚冻融移植的临床结局无明显差异。在我们之前的研究中也发现D5组的囊胚种植率要明显高于D6囊胚但是仅仅种植率的差异并不能全面代表D5或D6囊胚的发育潜能，还要考虑到着床后的流产率和新生儿的出生结局。有研究显示囊胚移植后新生儿发生早产和低体重的机率增加，也有研究显示冷冻复苏的囊胚移植后发生巨大儿的比例增加，还有研究显示延长培养至囊胚阶段并不影响新生儿结局。然而这些都是将囊胚与卵裂期胚胎进行的比较，目前尚无研究来比较D5和D6的囊胚冻融移植后的新生儿出生结局。因此，本研究按照冷冻前形成囊胚的时间（D5或D6）进行分组，比较D5或D6两组的新生儿出生结局。为了避免多胎对结果的影响，我们根据分娩胎数分为单胎组和双胎组，分别在单胎组和双胎组分别比较D5和D6两组新生儿的出生结局。进一步为复苏日囊胚的选择提供指导。对象与方法一、研究对象及分组收集2005年1月至2012年12月在我院生殖中心进行囊胚复苏移植并已分娩的患者资料，共纳入515例，进行回顾性分析。所有囊胚均采用玻璃化法进行冷冻和复苏。根据冷冻前形成囊胚的时间（D5或D6）分组：在受精后第5天形成囊胚者,定义为D5组;在受精后第6天形成囊胚者,定义为D6组。剔除在一个复苏周期中同时行D5和D6冻融囊胚移植的患者。并根据分娩胎数将患者分为单胎组和双胎组。二、研究方法1.囊胚培养：获卵后常规体外受精或卵胞浆内单精子注射（ICSI）授精。获卵后第1天观察卵母细胞受精情况，获卵后第3天挑选优质胚胎进行卵裂期胚胎移植；移植后的剩余胚胎经患者知情同意全部进行囊胚培养，在受精后第5天或第6天分别观察囊胚形成情况及形态，采用Gardner评分系统对囊胚进行评分。2.胚胎冷冻和复苏：本中心全部采用玻璃化冷冻方法进行胚胎冷冻。囊胚冷冻方法参照以前文献所述。囊胚冷冻之前进行人工皱缩，然后将囊胚放入预平衡液中平衡2min，之后将胚胎转移入玻璃化冷冻液中平衡30s，将胚胎转移至冷冻环（cryoloop环）上，直接浸入液氮保存。囊胚复苏在移植当天进行：将含有囊胚的冷冻环从液氮中取出后将胚胎浸入复苏液中，复苏后的囊胚全部进行激光辅助孵化!将复苏囊胚移入提前准备好的囊胚培养液（G2，Vitrolife，瑞典）中，放入37℃、6%CO2和5%O2的培养箱内培养2h。移植前评估胚胎的存活情况，囊胚腔重新扩张判断为囊胚存活。3.子宫内膜准备及胚胎移植：子宫内膜准备方法如之前文章所述：（1）自然周期法：排卵前注射HCG（艾泽，雪兰诺，瑞士）2000U，之后超声监测到卵泡破裂后开始给予黄体支持（肌注黄体酮20~40mg/d），在排卵后第6天移植胚胎；（2）人工周期法：月经第2~4天常规B超检查，口服戊酸雌二醇（补佳乐，先灵，德国）。B超监测内膜，当内膜厚度达到8mm时肌注黄体酮（20mg×2d、40mg×2d、20~40mg×1d），第6天进行囊胚复苏移植。胚胎移植均在B超引导下进行，每周期移植1~2个胚胎。移植后常规采用肌注黄体酮进行黄体支持。4.随访：所有产妇于分娩后1~3个月进行电话随访。内容包括产科并发症、新生儿的出生日期、分娩方式、孕龄、新生儿性别、出生体重、体长、出生时的Apar评分、出生缺陷等。三、分析指标及判定标准移植后第7日测血清HCG5U/L则判断为生化妊娠，若移植后4周超声检查见胎心和胎囊则判断为临床妊娠。孕龄是指末次月经第1天起至分娩时为止的一段时间；足月儿是指孕龄满37周（259d）而未满42周（294d）的新生儿；早产儿是指孕龄满28周（196d）而未满37周（259d）的新生儿；正常出生体重是指出生体重在2500~4000g之间者；低出生体重儿（LBW）是指出生体重2500g者，其中体重不足1500g者称为极低体重儿（VLBW）；巨大儿是指出生体重≥4000g者。Apar评分满10分者为正常新生儿，评分7分以下的新生儿考虑患有轻度窒息，评分在4分以下考虑患有重度窒息。四、统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计学分析，对计量资料进行t检验，对分类变量资料采用卡方检验，以P0.05为差异有统计学意义。结果一、D5和D6囊胚复苏移植的出生结局比较D5组的孕龄为（258.8±17.2）d，显著低于D6组（262.6±14.7）d，差异有统计学意义（P0.05）。但是D5的双胎生率也显著高于D6组（P0.05），因此孕龄的差异与D5组和D6组的双胎发生率差异有关（表1）。尽管D5组新生儿的出生体重[(2976.2±695.2)g]和出生身长[(48.8±3.2)cm]，均低于D6组，但无统计学差异（P0.05）。两组的剖宫产率都非常高（91.9%vs92.8%），但组间无统计学差异（P0.05）。D5组低出生体重的发生率（23.3%）高于D6组（15.1%），而D5组巨大儿的发生率（6.4%）略低于D6组（7.8%），但均无统计学差异（P0.05）（表1）。D5组共出生406个新生儿，其中男孩222个，女孩184个，男女性别比为1.21；而D6组分娩258个新生儿，男女性别比为1.01（130:128），组间无统计学差异（P0.05）（表1）。二、单胎新生儿出生结局比较为了排除D5组和D6组双胎发生率对出生结局的影响,我们将单胎和双胎分娩的出生结局分别加以统计分析。所有单胎分娩的患者平均年龄为（31.7±4.0）岁，共分娩新生儿366个，孕龄、出生体重和出生身长分别为（267.3±13.7）d、（3384.1±565.7）g和（50.1±2.5）cm。其中D5组分娩210个新生儿，孕龄、出生体重和出生身长分别为（266.5±14.5）d、（3387.4±584.8）g和（50.1±2.7）cm，与D6组[分别为（268.5±12.6）d、（3379.7±540.8）g和（50.1±2.1）cm]相比无统计学差异（P0.05）（表2）。D6组未出生极低出生体重儿，D5组的低出生体重率略高于D6组，D5组的巨大儿发生率略低于D6组，但两组相比无统计学差异（P0.05）（表2）。D5组的男女性别比（1.21）略高于D6组（1.08），但无统计学差异（P0.05）。另外，在D5组发生1例出生缺陷为动脉导管未闭合并脑积水，发生2例轻度新生儿窒息（Apar评分为7分），1例新生儿死亡；在D6组发生1例新生儿窒息（表2）。三、双胎新生儿出生结局比较双胎分娩的患者平均年龄为（31.8±4.1）岁，149例患者共分娩298个新生儿，孕龄、出生体重和出生身长分别为（251.6±15.3）d、（2555.1±504.9）g和（47.3±2.9）cm。其中D5组分娩196个新生儿，新生儿的孕龄、出生体重和出生身长与D6组相比无统计学差异（P0.05），但是D5组新生儿的出生体重（2531.0±505.4）g略低于D6组的（2601.8±503.0）g（表3）。两组均未出生巨大儿，D5组的低出生体重儿发生率（42.3%）高于D6组（31.4%），但无统计学差异（P0.05）。D5组男女性别比（1.20）高于D6组（0.92），但无统计学差异（P0.05）。另外，在D5组发生的2例轻度新生儿窒息（Apar评分为7分），D6组发生1例出生缺陷为双侧睾丸未降（表3）。讨论在胚胎的体外发育过程中，卵裂期胚胎发育至囊胚阶段时，经过再选择，发育潜能差的胚胎会被淘汰，因此认为进行囊胚移植更符合自然形态，更有利于胚胎着床，从而获得更好的临床结局。多数胚胎会在受精后D5或D6形成囊胚。我们将形成的囊胚进行玻璃化冷冻保存，之后再进行复苏移植。在前面的研究中我们发现D5的囊胚移植后的种植率、临床妊娠率和活产率均高于D6组囊胚，这与很多学者的研究结论相似。但是，关于D5和D6的囊胚复苏移植后的新生儿出生结局分析的研究极少’因此本文对两组胚胎的出生结局进行了比较。在本研究中，我们发现D5组的孕龄为（258.8±17.2）d，显著低于D6组（262.6±14.7）d，而且D5组新生儿的出生体重(2976.2±695.2)g和出生身长(48.8±3.2)cm，也均低于D6组的(3075.8±648.5)g和(49.2±2.6)cm，但无统计学差异。分析原因可能与D5组的双胎发生率较高有关。因此，为了避免胎儿数对我们的结果产生混杂影响，我们根据患者分娩的胎数分为单胎和双胎分别分析。我们发现，在单胎患者中，D5组的孕龄为（266.5±14.5）d略低于D6组的（268.5±12.6）d，而且在D5组低出生体重的比例略高于D6组；在双胎分娩的患者，D5组的孕龄为（250.6±16.1）d略低于D6组的（253.6±13.4）d，、D5组低出生体重儿的比例高于D6组，而且我们发现D5组出生体重略低于D6组。虽然这些差异均无统计学意义，但是我们看到似乎存在这样一个趋势：在体外培养时间越长，移植怀孕后的孕周越长，而且出生体重越重。这与Makinen等的研究结论相似，他们发现移植D5或D6的胚胎后发生大于孕龄儿（LGA）的OR值明显高于移植D2的胚胎，因此认为体外培养时间越长，越容易发生大于孕龄儿。另外，在瑞典最近的两项研究中，也发现随着胚胎在体外培养时间的延长，发生小于孕龄儿（SGA）的比例降低（从3。2%下降至2.5%），尽管无统计学差异。但是也有不同的研究结论。最近一项大型研究发现，不论胚胎在体外培