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RS/TN/ZL-004分光光度法测定蛋白酶酶活版号/修改:A/0共5页第1页分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下,水解酪素(酪蛋白)底物,产生含有酚基的氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Folin)还原,生产钼蓝和钨蓝,用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比,由此可以计算产品的酶活力。酶活单位的定义:每1mL粗酶液,在一定温度和pH值条件下,10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位,以(u/mL)表示。3仪器和设备3.1分析天平:精度为0.0001g。3.2紫外分光光度计。3.3恒温水浴锅:精度±0.2℃。3.4PH计:精度为0.01PH单位。4试剂和溶液除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。4.1福林(Folin)试剂市售分析纯福林试剂。4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合,摇匀。4.3碳酸钠溶液(42.4g/L)称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,用水溶解并定容至1000ml。4.4三氯乙酸c(CCl3COOH)=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,用水溶解并定容至1000mL。4.5氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g,加水900ml并搅拌溶解,待溶液到室温后加水定容至1000ml,摇匀。4.6盐酸溶液c(HCL)=1mol/L及0.1mol/LRS/TN/ZL-004分光光度法测定蛋白酶酶活版号/修改:A/0共5页第2页1mol/LHCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1000mL。0.1mol/LHCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1000mL。4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液(pH=7.5,适用于中性蛋白酶)称取磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4•12H2O)0.5g,加水溶解并定容至1000mL。4.7.2乳酸缓冲液(pH=3.0,适用于酸性蛋白酶)甲液:称取乳酸(80%~90%)10.6g,加水溶解并定容至1000mL。乙液:称取乳酸钠(70%)16g,加水溶解并定容至1000mL。使用溶液:取甲液8mL,加乙液1mL,混匀,稀释一倍,即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。4.810g/L酪素溶液称取酪素(固定厂家生产,不同厂家产品对实验结果有影响)1.000g,精确至0.001g,用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2~3滴)湿润后,加入适量的缓冲溶液(测中性蛋白酶加磷酸缓冲液,测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液)约80mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直到完全溶解,冷却后,转入100mL容量瓶中,用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天。4.9L-酪氨酸标准溶液(100μg/mL)称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g,精确至0.0002g,用1mol/L盐酸60mL溶解后再用蒸馏水定容至100mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL,用0.1mol/L盐酸定容至100mL,即得到100ug/mLL-酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。5分析步骤5.1标准曲线的绘制5.1.1L—酪氨酸标准溶液:按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。表1管号酪氨酸标准溶液的浓度(μg/mL)取100ug/mL酪氨酸标准溶液的体积mL取水的体积mL吸光值Abs.000101101922028330374404655055RS/TN/ZL-004分光光度法测定蛋白酶酶活版号/修改:A/0共5页第3页分别取上述溶液各3.00ml,各加碳酸钠溶液(4.3)15.00ml、福林试剂使用溶液(4.2)3.00ml,振荡均匀,置于40℃±0.2℃水浴中显色20min,取出冷却至常温,用分光光度计于波长680nm测定其吸光度(A),以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线(此线应通过零点)。根据作图或用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(μg),即为吸光常数K值;(其K值应在(95~100)范围内)。如不符合,需重新配制试剂,进行试验。5.2样品测定5.2.1待测酶液的制备液体酶样:准确吸取样品10.0ml于100ml容量瓶中,用适宜溶剂(蒸馏水或者缓冲溶液)定容至刻度。控制稀释样品酶活力在100u/ml—1000u/ml范围内。固体酶样:准确称取样品4.0g,精确至0.0002g。用适量适宜溶剂(蒸馏水或者缓冲溶液)溶解后,定容至100ml。再将定容溶液用定性滤纸过滤后,准确吸取10.0ml,用相应溶剂定容至100ml。控制稀释样品酶活力在100u/ml—1000u/ml范围内。5.2.2测定a、先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中,预热5min;b、按下列程序操作:试管A(空白)试管B(酶试样,需作三个平行试样)加酶液4.00mL加酶液4.00mL↓↓40±0.2℃保温,2min40±0.2℃保温,2min↓↓加三氯乙酸8.00mL(摇匀)加酪素4.00mL(已预热)(摇匀)↓↓沸水煮沸,10min(精确计时)40±0.2℃保温,30min(精确计时)↓↓加酪素4.00mL(已预热)(摇匀)加三氯乙酸8.00mL(摇匀)↓↓40±0.2℃保温,30min,过滤(定性滤纸)沸水煮沸,10min,过滤(定性滤纸)↓↓取3.00ml滤液取3.00ml滤液↓↓加碳酸钠溶液15.0ml加碳酸钠溶液15.0mlRS/TN/ZL-004分光光度法测定蛋白酶酶活版号/修改:A/0共5页第4页↓↓加福林试剂使用溶液3.00ml加福林试剂使用溶液3.00ml↓↓40±0.2℃,显色20min40±0.2℃,显色20min↓↓冷却至常温冷却于680nm波长,测定样品酪氨酸浓度6结果计算6.1液体样品酶活力的计算从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力,单位为u/ml。样品的酶活力按式(1)计算:4331621nCX(1)式中:X—样品的酶活力,(u/mL);C—由标准曲线得出的检测试液的酶活力,(u/mL);21—检测试液的体积,ml;16—反应试液的总体积,mL;n—所测样品的稀释倍数;3—反应时间为10min的倍数;3—吸取滤液的体积,ml;4—加入酶液的体积,mL;所得结果表示至整数。6.2固体样品酶活力的计算固体样品的酶活力换算按式(2)计算:mVXX''(2)式中:'X—固体样品的酶活力,(u/g);X—固体样品溶解定容后的酶活力,(u/mL);'V—样品定容体积,ml;m—称取样品的质量,g;RS/TN/ZL-004分光光度法测定蛋白酶酶活版号/修改:A/0共5页第5页所得结果表示至整数。7检验注意事项7.1缓冲溶液配制注意事项缓冲溶液配制完成后,用PH计测定其PH值,若PH值不在规定范围内,需用相应的试剂调PH值至规定要求。7.2多个样品同时检验注意事项如果有多个样品进行检测,样品处理过程:预热→加酶液→保温→加三氯乙酸→沸水煮沸,需要分别单独进行操作和计时,加酶液及试剂的时间控制在1min以内。附则:本方法自2015年5月5日实施。本方法的编制与修订属于质量管理部。编制人:审核人:批准人:
本文标题:分光光度法测定蛋白酶酶活
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