分子发光分析论文

分子发光分析课程论文题目超分辨率荧光显微成像技术研究进展ProgressinSuper-resolutionFluorescenceMicroscopyImagingTechniques姓名金鑫学号2013310201019学院理学院专业班级应化1303中国·武汉二〇一六年四月摘要2014年诺贝尔化学奖授予了三位科学家，以表彰他们在超分辨率荧光显微成像技术方面的重大贡献。本文就这一技术的发展历程进行简要概述，并对于超分辨率荧光显微技术的发展前景进行展望。关键词:诺贝尔奖，超分辨，显微成像AbstractTheNobelPrizeinChemistrywasawardedtothreescientistsin2014,inrecognitionoftheirsignificantcontributiontothesuper-resolutionfluorescencemicroscopyimagingtechniques.Inthispaper,abriefoverviewonthecourseofdevelopmentofthistechnology,andprospectsforthedevelopmentofsuper-resolutionfluorescencemicroscopytechniqueswillbediscussed.KeyWords:NobelPrize,Super-resolution,Microscopyimaging1绪论1.1传统的分辨传统的分辨可以定义为：如果点扩展函数较大，那么对于两个靠得很近的点，则不能分辨。在此基础上，实现超分辨的方法可分为两类：基于点扩展函数调制的超分辨技术，使得点扩展函数变小；基于随机单分子定位的超分辨技术，使得没有靠得很近的两个点同时发光[1]。1.2超分辨率简介基于点扩展函数调制的超分辨技术的代表为受激发射光淬灭（简称STED）技术[1]。早在1994年，此次获奖的罗马尼亚裔德国科学家StefanW-Hell最先提出了打破光学衍射极限的构思，并最终于2000年在实验上得以实现[5]。基于随机单分子定位的超分辨技术的核心是，如果图像上的点不是同时。亮起来，也就是不会有两个靠得很近的点同时亮，就可以通过定位的方式实现超分辨。虽然一次定位只能得到少数几个分子，但是通过数千张图片对数十万个单分子的定位，就可以获得一张高分辨率的图像[1]。2荧光显微镜的发明历程2.1光学显微镜光学显微镜自发明伊始，即与生命科学结下了不解之缘。16世纪末期，荷兰眼镜商ZacchariasJanssen和他的儿子把两个凸透镜放到一个镜筒中，结果发现镜筒能放大物体，这就是显微镜的前身。随后，荷兰人AnthonyVonLeeuwen-hoek通过精密研磨的玻璃透镜，首次将复式显微镜的分辨率提高到了300倍，并用它来观察牙缝中的微生物——细菌。后来，英国实验科学家RobertHooke对这一显微镜进行了系统的改进，用它来观察软木塞的微小结构。他看到了上面致密排列的小室，并将其命名为细胞，记录在他1665年创作的《显微镜》一书中[1]。2.2电子显微镜1872年，德国数学和物理学家ErnstAbbe根据光的波动性，得出了以下结论：对一个理想的发光点，在经过显微镜光学系统后，将是一个高斯型的艾里斑。由此可以想到无论一个样品结构有多复杂，总是能够描述为是由一个个点构成的，因此，这个点的像描述了光学系统的响应函数，或者称之为系统的分辨率。该函数即点扩展函数[1]。通过阿贝公式[2]，很容易想到的是，缩短波长即可产生更高的分辨率，比如利用X光，实际上电子的德布罗意波长是光波的千分之一，是属于X光的范畴。1986年，电子显微镜技术获得了诺贝尔物理学奖。2.3光学显微镜与电子显微镜的不足光学显微需要所看的对象“色彩斑斓”，而细胞一般是高度透明的。为了能够看到细胞内部结构，人们发明了染色技术。最常用的染色技术——HE染色能够利用2种染料对生物组织进行染色，目前仍是临床采用的判定肿瘤良恶性的金标准。然而，染色对于观察亚细胞结构仍存在较大挑战：染色是通过对光的直接吸收来产生的反差，也就是让细胞器有吸收，而周围没有吸收达到反差效果。光的吸收率可以用比尔定量描述，当样品的厚度非常小时，吸收率几乎为0，这也就是薄样品看上去几乎透明的原因。电镜使得过去不能够看到的样品细节能够被清晰地展现。但是，电镜却有着复杂、严苛的样品制备过程，如切片、脱水、固定、镀金等，这些均会破坏细胞的活性甚至改变其原有的结构。而且，电镜只能看到细胞内的结构，对于所观察到的结构的判断，则需要其他技术辅助辨别。2.4荧光染色传统的染色是吸收A波长，探测A波长的吸收率。为了解决这一问题，可以使系统吸收A波长，探测从样品染色上发出的B波长。这样，仅在有“染色”的地方发光，没有染色的地方是完全黑的，即荧光染色。1871年，JohannFriedrichWilhelmAdolfvonBaeyer因合成荧光素获1905年诺贝尔化学奖。在此基础上，能够特异性地标记细胞中的不同细胞器的荧光染色技术应运而生。2008年诺贝尔化学奖的绿色荧光蛋白能够通过外源性标记或者内源性转基因的方式选择性地让某一个感兴趣的细胞器发荧光，将活体成像往前推进了一大步[1]。图1HE染色病理切片图（a）与细胞荧光显微图（b）的对比2.5超分辨率荧光显微技术前文提到，Hell对于突破衍射极限的执着追求造就了STED技术的问世，而后引领的STED技术的发展和推广热潮成就了STED技术在超分辨成像领域的一席之地[4]。物理学出身的Betzig于2006年在《Science》杂志上发表文章正式提出了光激活定位超分辨显微镜。PALM/STORM均是通过对荧光分子的激活—定位—漂白三个步骤加之数万次的循环最终重构出超分辨图像。相比于STED技术，PALM/STORM在实现上更简单且成本更低，多色PALM成像、三维PALM成像、活细胞PALM成像以及厚样本PALM成像相继诞生，并且在生物学研究中迅速普及开来[4]。Moerner教授虽然没有直接提出超分辨成像的概念，却是第一个观察到单分子并对单分子性质进行详细测量的科学家[4]。3展望超分辨显微成像技术在问世十多年之后便迅速获得了诺贝尔奖，足见其对化学领域尤其是生物学领域的重大影响。时至今日，三大超分辨成像技术的理论基础已比较完备，但是其应用范围与普通共聚焦显微镜相比还有很大差距，因此此次诺贝尔奖的颁发势必会引起更多化学家、生物学家的重视，将更多的科研兴趣和研究重点投入超分辨显微成像技术上来。高昂的装备和维护费用也是影响超分辨成像技术推广的重要制约因素。因此如何进一步降低超分辨率研究的成本及其推广是目前人们需要关注的主要内容。参考文献[1]席棚,孙有杰.超分辨率荧光显微技术——解析2014年诺贝尔化学奖[J].北京大学科技导报.2015.[2]顾兆泰.超分辨荧光寿命显微方法及系统.浙江大学[D].2013.1.[3]纪伟,徐涛,刘贝.光学超分辨荧光显微成像——2014年诺贝尔化学奖解析.中国科学院生物物理研究所[J].2014.6.[4]李帅.超分辨荧光显微方法与系统研究.浙江大学[D].2014.1.7.[5]HellSW,WichmannJ.Breakingthediffractionresolutionlimitbystimulatedemission:stimulated-emission-depletionfluorescencemicroscopy[J].OpticsLetters,1994,19(11):780-782.[6]WilligKI,KellnerRR,MeddaR,etal.NanoscaleresolutioninGFP-basedmicroscopy[J].NatureMethods,2006,3(9):721-723课程心得本片文献主要介绍的是荧光金纳米粒子的发展历史，从最早的黄金和薄铜的光致发光一直到现代的各种粒径的荧光纳米金粒。人们合成了大量的多功能的荧光纳米金粒，它们的荧光量子产率也在不断提升。作者介绍了几个重要的关于合成纳米金的实验，并从纳米金的粒径、表面配体、金属原子的价态和纳米颗粒的结晶度等等结构因素，分析了它们对荧光纳米金粒发光的影响，并且用几个实验结果加以佐证。文献中还根据各种结构因素对纳米金荧光特性的影响还分析了可能的发光机理。纵观文献整体，由于是一片综述类型的文章，深度不深但是涉及的面非常广，要较好的加以理解需要查阅不少相关资料。在文献结尾处，作者说明了在纳米金微粒荧光机理方面的广阔前景。学生对于这一篇文献的主要心得就是这个地方，实际上现在的化学体系发展的已经比较完整了，但是在一些前沿领域，尤其是微观领域，虽有大量的实验数据，但是对于机理方面是相对比较薄弱的，很多现象只知道该怎么去做以及会成为什么样子，但是对于背后的机理还欠缺一些核心的理论支持，那么是不是去研究这些地方就一定会有很好的发展前景呢？学生认为是否定的，机理实际上就是大量的实验数据所遵循的潜在的某种规律，基本上只需要足够多的实验数据，再加上一些运气的成分以及能够识破本质的天分，发现机理的必然性就确定了，剩下的只是时间的问题。所以没有必要去追求那个“空中楼阁”，该出来的时候就会出来了，毕竟这个世界上大部分的天才都是依靠努力的。翻译正文不同尺寸的荧光金纳米粒子JieZheng,ChenZhou,MengxiaoYuandJinbinLiu经过十多年的努力，大量具有不同的尺寸和表面化学性质的高荧光金属纳米粒子已被开发。荧光通常被认为是受微粒大小的影响，至于其它的结构因素，例如表面配体，金属原子的价态和纳米颗粒的结晶度也会对荧光的特性与发光机制有重要的影响。在这篇综述中，我们总结了如何去制造从几个原子到百万数量级原子数的荧光金纳米粒子的方法并讨论了这些结构因素是如何影响它们的光致发光。1.引言在纳米级尺寸下，金是一种很好的材料，它具有可调控的电子结构和广泛的材料特性。毫无疑问，纳米金颗粒的表面等离子共振吸收是其最迷人的财产，本质上它是由于大量的自由电子在连续能带中集体震荡产生的，可以通过改变粒径等结构参数来进行调节。例如，对于粒径大于光的波长的纳米金颗粒，其频率和表面等离子体的带宽可以用Mie氏散射理论定量地描述。当颗粒尺寸接近电子的平均自由路径（对于金约为50纳米），粒径的减少会导致表面等离子激元蓝移，这仍然可以用改进的Mie理论解释。其他的结构参数，如形状、聚集度、组成和表面粗糙度也显著影响表面等离子体及其相关性质，如表面增强拉曼散射（SERS）和光热转换等。许多优秀的评论将帮助读者全面了解这些知名纳米金的等离子体特性。在这篇综述中，我们专注于金纳米粒子的荧光特性，这比表面等离子激元更难理解。经过十年的努力，发光金属纳米粒子已成为一类新兴的金属纳米结构。新的不同大小，高量子产率的发光金纳米粒子的合成方法已经得到了发展，部分发光机制已经被阐明，多种纳米金粒子的应用已被展示。尺寸为0.3到20纳米的荧光纳米金粒子可以通过调谐不同的结构参数，如粒度，表面配体，价态和晶粒尺寸来合成，有必要总结这些因素是如何影响发光性能和机制的，这可能有助于发光金属纳米粒子的应用和未来的发展。发光金纳米粒子已在过去的十年里被深入的研究，金的发光观察最早可追溯到1969年。Mooradia用488纳米的激光激发黄金和铜的薄膜，分别在564和620纳米处观察到光致发光。由于黄金或铜膜具有连续导通的能带结构，观察到的量化转换（发光）并不是因为带内跃迁而是由于带间跃迁产生的。图一是是首次被提出的能够解释金和其它金属薄膜的光致发光的光学机制，这个辐射机制产生于D带上有空穴的费米能级上的电子重组。在观察金属的光致发光时，具有一个非常大的态密度和大量的自由电子的系统相比传统的已知的荧光基团是相当不寻常的，在这项工作发表后的前20年里，很少有人注意这一领域。部分原因是由于量子产率仅-1010，对于详细理解和实际应用金属辐射来说太小了。在1986年，由于在对金属薄膜的表面增强拉