分子实验15蛋白质的抽提及裂解

蛋白质的抽提及裂解细胞核蛋白的抽提Activemotif公司的试剂盒一、缓冲液的配制（根据细胞数量来定缓冲液的量）ReagenttoPrepareComponents60mm皿或3.2X106细胞100mm皿或8.8X106细胞150mm皿或2X107细胞PBS/PhosphataseInhibitors10xPBS0.4ml0.8ml16ml去离子水3.4ml6.8ml13.6mlPhosphataseInhibitors0.2ml0.4ml0.8ml总体积4.0ml8.0ml16.0ml1xHypotonic缓冲液10xHypotonic缓冲液25.0ul50.0ul100.0ul去离子水225.0ul450.0ul0.9ml总体积250.0ul500.0ul1.0mlCompleteLysis缓冲液10mMDTT2.5ul5.0ul10.0ulLysis缓冲液AM122.25ul44.5ul89.0ul蛋白酶抑制剂0.25ul0.5ul1.0ul总体积25.0ul50.0ul100.0ul5×蛋白质变性缓冲液10ml1MTris-HCl(pH6.8)0.6ml50%甘油5ml10%SDS2ml2-巯基乙醇0.5ml1%溴酚蓝1ml去离子水0.9ml可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。二、操作步骤：1．细胞用预冷的5mlPBS/PhosphataseInhibitors缓冲液洗1次，再加3ml预冷的PBS/PhosphataseInhibitors缓冲液，用细胞刮器将细胞刮下来，转入15ml离心管。2．1500rpm，4℃离心5分钟，去上清。3．加500ul预冷的1xHypotonic缓冲液与细胞混匀，转入1.5ml离心管，置冰上15分钟。4．加25ulDetergent缓冲液震荡10秒。5．14000g,4℃离心30秒，去上清。6．加50ul预冷的CompleteLysis缓冲液，混匀10秒，置冰上摇床乳化30分钟，150rpm.7．震匀30秒后，14000g,4℃离心10分钟。8．取上清转至PCR管，80ul/管，-80℃冻存或者每管加20ul5X蛋白质变性缓冲液，混匀。9．在PCR仪上99.9℃，变性10分钟，-80℃冻存。组织核蛋白的抽提一、缓冲液的配制（根据细胞数量来定缓冲液的量）ReagenttoPrepareComponents60mm皿或3.2X106细胞100mm皿或8.8X106细胞150mm皿或2X107细胞PBS/PhosphataseInhibitors10xPBS0.4ml0.8ml16ml去离子水3.4ml6.8ml13.6mlPhosphataseInhibitors0.2ml0.4ml0.8ml总体积4.0ml8.0ml16.0ml1xHypotonic缓冲液10xHypotonic缓冲液25.0ul50.0ul100.0ul去离子水225.0ul450.0ul0.9ml总体积250.0ul500.0ul1.0mlCompleteLysis缓冲液10mMDTT2.5ul5.0ul10.0ulLysis缓冲液AM122.25ul44.5ul89.0ul蛋白酶抑制剂0.25ul0.5ul1.0ul总体积25.0ul50.0ul100.0ul二、操作步骤：1.组织称重，准备干净的匀浆器置冰上预冷。2.在1g的组织中，加3ml冰上预冷的1xHypotonic缓冲液，加3ul1MDTT，加3ulDetergent缓冲液，混匀，把组织匀浆后转入15ml的离心管，置冰上15min.3.850g,4℃离心10分钟,去上清。4．1g的组织相当于150mmPlate(2X107细胞),加50ulDetergent缓冲液震荡10秒。5.14000g,4℃离心30秒，去上清（上清为胞浆蛋白）。6.加100ul预冷的CompleteLysis缓冲液，混匀10秒，置冰上摇床30分钟，150rpm.7.震匀30秒后，14000g,4℃离心10分钟。8.取上清转至PCR管，80ul/管，-80℃冻存或者每管加20ul5X蛋白质变性缓冲液，混匀。9.在PCR仪上99.9℃，变性10分钟，-80℃冻存。新鲜皮肤组织、肌肉组织、胎盘组织中蛋白质的提取材料准备：剪刀、镊子、皿、1XPBS、1.5ml离心管、PCR管、匀浆器1、取新鲜的组织用PBS洗一次，在加有蛋白酶抑制剂的PBS中剪碎后，全部转入匀浆器中匀浆。2、取上清分装在1.5ml离心管中，14000g，4℃离心10分钟。3、取上清转至PCR管，80ul/管，每管加20ul5X蛋白质变性缓冲液，混匀。4、在PCR仪上99.9℃，变性10分钟，-80℃冻存。患者外周血、骨髓的蛋白质抽提和裂解1、在新鲜的外周血、骨髓中加淋巴细胞分离液用离心的方法分离有核细胞。2、在有核细胞中加5X蛋白质变性缓冲液，混匀。3、在PCR仪上99.9℃，变性10分钟，-80℃冻存。