分子生物学(14EB2)打印11

分子生物学2016-6-21周二8：30南5第一章基因表达调控miRNA，siRAN，cDNA，反式作用因子，顺式作用因子，绝缘子，操纵子，核小体，管家基因，乳酸操纵子调控，原核和真核生物基因表达调控不同。第二章细胞周期，干细胞发育，抑癌基因，p53基因。第三章基因工程基因文库，质粒特点，质粒的构象，限制性内切酶特点，基因工程载体条件，基因工程的过程，获取目的基因的方法，PCR过程。第五章分子杂交分子杂交，探针，northern,southern,western.第六章基因诊断与基因治疗基因诊断对象，基因诊断技术，基因治疗过程，SNP(单核苷酸多态性),RFLP(限制性酶切长度多态)。参考资料第一章基因表达调控操纵子（operon）操纵子是原核生物基因表达和调控的基本单元，由编码功能相关蛋白的多个结构基因和共同的调控序列组成管家基因（housekeepinggene）：某些基因产物对生命全过程都是必需的或必不可少，且较少受环境因素的影响SiRNA：将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默，这种转录后基因沉默机制被称为RNA干扰(RNAi)。参与RNAi过程的双链小分子RNA称为小干扰RNA(siRNA)核小体：（染色体的基本组成单位）由DNA和5种组蛋白共同构成的。各两分子的H2A,H2B,H3和H4组成一个八聚体的组蛋白核心，长度约146bp的DNA在组蛋白核心上盘绕1.75圈。组蛋白核心和其上的DNA形成核小体的核心颗粒。核心颗粒之间再由组蛋白H1和连接DNA构成的连接区连接形成串珠样结构。绝缘子：是一组在真核生物基因组中建立独立转录活性区的调控元件，具有两种性质，一，当绝缘子位于增强子或者沉默子与启动子之间时可以阻断增强子对启动子的作用。二，绝缘子可以使其界定的基因表达不受位置效应的影响。(如在转基因时，目的基因整合到染色体上的不同位置，因位置效应作用基因的表达水平差异很大。但是如果在目的基因的两侧连接上绝缘子，目的基因往往不受染色体位置效应的影响)微小RNA（miRNA）:长约22nt的非编码RNA，广泛存在于从病毒到人类的各种生物中。这些小RNA能够与靶mRNA结合后，通过降解靶mRNA或阻断其蛋白合成而调控基因表达cDNA:以mRNA为模板,利用逆转录酶合成与mRNA互补的DNA即为cDNA顺式作用元件（cis-actingelement）:同一DNA分子上具有可影响或调控转录的各种片断1、核心启动子成分:如TATA框（转录因子与DNA结合部位）2、上游启动子成分:如CAAT框与GC框（影响转录起始的频率）、八聚体（ATF结合位点）3、远上游元件：增强子、减弱子4、特殊启动子成分和反应性元件反式作用因子（trans-actingfactor）:能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA或RNA聚合酶的蛋白质1、通用反式作用因子2、特殊组织与细胞中的反式作用因子3、和反应性元件相结合的反式作用因子反式作用因子通过以下三个途径发挥作用1、蛋白质直接和DNA结合(螺旋转角螺旋、锌指结构、亮氨酸拉链、碱性螺旋-环-螺旋、同源异型结构域)2、蛋白质与配体结合3、蛋白质与其他蛋白质的结合及其修饰乳糖操纵子调控:（结构见于生化P366）负性调控:无乳糖，由lacI基因所编码的阻遏蛋白与lacO序列（操纵序列）结合，转录抑制有乳糖，由lacI基因所编码的阻遏蛋白与乳糖结合，转录激活正性调控:有葡萄糖，cAMP浓度高，与cAMP受体蛋白结合形成CAP，CAP与CAP结合位点结合，转录激活无葡萄糖，cAMP浓度低，不能形成CAP，转录受抑制因此，只有在有乳糖且无葡萄糖的条件下，转录才能激活真核生物与原核生物基因表达调控的区别（课本P13、14）1、结构不同：分子水平（DNA含量及组成差异）、细胞水平（单/多顺反子，单/二倍体，）2、功能不同：瞬时调控或可逆性调控；发育调控或不可逆性调控真核生物基因表达调控的特点:1、单顺反子编码基因;原核生物常为多顺反子结构2、DNA与组蛋白和非组蛋白结合;原核生物DNA裸露3、断裂基因4、DNA重排和基因拷贝数变化5、转录调节区域较大6、多层次调控（经成熟和剪切等过程后，才能被顺利翻译成蛋白质）7、核膜的空间间隔（核内转录核外翻译）;原核生物边转录边翻译第二章一、细胞周期1.细胞周期的定义上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂的结束，亲代细胞有一个分裂为两个子细胞的过程。2.细胞周期的概述一个细胞周期包括准备阶段的间期和有丝分裂期。间期包括G1、S和G2期。G1期时，细胞为遗传物质DNA的合成做准备，而DNA的合成是在S期完成。G2主要完成蛋白质的合成，为细胞进入有丝分裂期做准备。有丝分裂期（M期）又分为前期、中期、后期和末期，以完成染色体的凝集，中性粒移至细胞核对立的两极，核仁解体，核膜消失（前期）；纺锤体形成和染色体排列于其间；姐妹染色单体分开并移向两极（后期）；子核形成和胞质分裂（末期）。另外，G1期的细胞也可能处于一种静息状态，细胞不生长，也不分化。称之为G0期。3.细胞周期的调控相关因子调控系统由周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)、细胞周期素(Cyclin)、细胞周期蛋白泛素化降解蛋白和细胞周期蛋白激酶抑制因子(CKI)组成⑴周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）CDK决定细胞能否通过R点，CDK通过调节下游其他蛋白质而发挥作用。CDK本身无催化蛋白质磷酸化的活性，在细胞周期的特定时相，它们可与相应的周期素（Cyclin）结合成复合物。一方面，复合物中周期素作为调节亚基，从而调节复合物的激酶活性和底物特异性。另一方面，复合物的CDK磷酸化和去磷酸化。这些被磷酸化的蛋白质能使细胞进入细胞周期的下一时相。周期素与CDK发挥激酶活性所必需，但仅周期素与CDK结合，并不能使CDK激活，只有T-loop中Thr161残基磷酸化才能使CDK得以激活，它的磷酸化是酶活性所必需的。CDK1与周期素A和周期素B使靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应，结果是细胞周期不断运行。CDK2参与G1、S期基因表达的调控。CDK3与细胞从G1期进入S期相关CDK4与周期素D启动核内靶基因的转录。CDK5神经发育中起作用的蛋白激酶。CDK6与CDK4相近。CDK7即CAK，磷酸化Cyclin-CDK复合物中的多个位点。⑵周期蛋白(周期素Cyclin)周期蛋白与CDK结合使CDK活化。周期素根据作用时期不同可以分为G1期周期素(G1期发挥作用)和M期周期素(G2/M期发挥作用)。前者包括CyclinC、D、E，后者包括CyclinA、B。CyclinC在G1中点达到最大值，在其他期变动小。CyclinD在在细胞周期中持续表达。与CDK结合使Rb蛋白磷酸化，释放出转录因子E2F，促使基因转录，如编码CyclinA、E和CDK1的基因，使细胞进入S期。CyclinE在M期晚期和G1早期开始表达，并逐渐积累，到达G1晚期达最大。然后逐渐水解，到G2期达最低值。与CDK2结合促进细胞通过G1/S限制点进入S期，是激活DNA复制起始因子，是使细胞进入S期的关键蛋白激酶。CyclinA在G1期表达并积累，一直持续到G2/M期。与CDK1、CDK2形成复合物，启动DNA复制，为M期所需蛋白质合成做准备。CyclinB从S期开始表达并增加，到G2期后期达到最大值，并一直维持到M期中期阶段，然后迅速降解。CyclinB1使CDK1接近合适的底物。⑶细胞周期蛋白激酶抑制因子(CKI)对CDK激酶起负性调控，能结合和钝化Cyclin-CDK复合物，从而调节细胞周期。INK家族(p15、p16、p18、p19)和CIP/KIP家族(p21、p27、p57)p21抑制各种Cyclin-CDK复合物蛋白激酶活性，主要对G1期CDK起负性调控作用。p27抑制已激活的Cyclin-CDK复合物，抑制CDK激活过程。p16与CyclinD竞争结合CDK4/6，阻止与周期素结合，抑制蛋白激酶活性，抑制CDK4/6介导的Rb蛋白磷酸化，阻止细胞从G1期进入S期。p15主要在G1晚期抑制细胞从G1期进入S期。⑷细胞周期蛋白泛素化降解蛋白泛素化在分裂后期促进因子(APC和SCF)介导下完成。泛素激活酶E1水解ATP获能激活泛素，E1将泛素交给泛素结合酶E2，在泛素连接酶E3的作用下将泛素转移到靶蛋白上，SCF将泛素连接G1/S期Cyclin-CDK上，APC将泛素连接M期Cyclin-CDK上。周期素结合识别CDK，组成Cyclin-CDK复合物，表现出CDK激酶活性，M期降解盒通过泛素连接酶催化泛素与CyclinA、B结合，Cyclin最终水解。4.细胞周期的调控细胞周期有三个检查点，分别为G1/S检查点（R点）,G2/M检查点和中后期检查点(又称为纺锤体组装检查点)⑴G1期。CyclinD和CDK4/6启动DNA复制，使细胞周期从G1期顺利到达S期。CyclinE和CDK2使细胞通过R点，使细胞从G1期到达S期。当细胞损伤或者异常增殖时，⑵S期CyclinA与CDK2推动S期向前进。⑶G2期CyclinB和CDK1使细胞成熟，进行有丝分裂。CyclinA和CDK1将细胞向M期推进。二、抑癌基因1.抑癌基因的定义抑癌基因是一类抑制细胞过度成长并有着潜在抑癌作用的基因，其编码产物的功能主要有诱导细胞分化，维持基因组稳定，触发衰老及诱导细胞程序性死亡。2.抑癌基因失活机制突变、重排、甲基化、缺失、表达受抑等。3.抑癌基因举例⑴Rb基因第一个被发现的抑癌基因，通过影响细胞周期调控细胞增殖。Rb定位于13q14，全长200kbp，含27个外显子，是G1期Cyclin2CDK复合物介导的磷酸化作用的共同的限速底物，因此是G1到S调控点的中心成分。机制:生长因子结合相应的受体，通过信号传递促进Cyclin基因表达→Cyclin与相应CDK结合为激酶复合物，在CAK协同下对Rb蛋白磷酸化→磷酸化Rb释放其结合的核转录因子以及具有激酶活性的c-2Ab1蛋白→游离的E2F进入核内结合一系列具特殊序列的基因启动子区，促进这些基因的表达→这些基因的产物促进细胞通过G1→S调控点，进入自主分裂程序。CKI通过抑制CDK或Cyclin2CDK的活性，使pRb保持去磷酸化且结合E2F及其他蛋白的状态，从而抑制细胞增殖。⑵p53基因p53可以通过激活Rb基因的启动子，上调pRb的表达；或者通过抑制CDK4的活性，下调CDK4的表达。当细胞DNA受损后，p21基因在p53诱导下表达水平可升高，能抑制CDK活性CyclinD2CDK4复合物活性，阻止细胞从G1期进入S期，使细胞停止于G1期。如果DNA损伤严重无法修复，将导致细胞凋亡。三、干细胞发育干细胞是一种具有自我更新和分化潜能的细胞。干细胞根据所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据发育潜能分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能或单能干细胞。第三章基因工程一.基因文库（genelibrary）：1.概念：是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。1)基因组文库（genomiclibrary）：是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的片段，然后连接到某种载体上转化受体细胞而形成的克隆的集合。（存在于转化细菌内由克隆载体所携带的有基因组DNA的集合。）2)cDNA文库（cDNAlibrary）：是指某生物某一发育时期、某一组织或某种环境条件下所转录的mRNA经逆转录形成的cDNA片段与载体连接转化受体细胞而形成的克隆的集合。2.基因组文库构建的基本步骤:【PPT】（1）基因组DNA的提取及片段化（2）载体的选择和制备（3）DNA片段与载体连接形成重组DNA（4）重组DNA转化宿主细胞【课本】(1)细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备(2)载体DNA的制备(3)载体与外源大片段连接(4)体外包装及基因组DNA文库的扩增(5)重组DNA的筛选与鉴定二.限制性内切酶的特点【