分子生物学技术

PCR1、概念：聚合酶链式反应，简称PCR，是一种分子生物学扩增技术，即试管内DNA扩增，将目的基因或某一DNA片段于数小时内体外扩增至百万倍,千万倍。可看作生物体外的特殊DNA复制。特点：简便、特异、快速、灵敏、产率高、重复性好、易自动化等。2、基本原理：实际上是在模板DNA，引物，和四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）存在的条件下依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。步骤：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：1):模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右后，双链DNA变性为单链DNA；2):模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3):引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将目的基因扩增放大几百万倍。标准的PCR反应体系：五要素（引物、Taq酶、dNTP、模板、Mg2+）；PCR过程中产物持续增加（初期增加呈指数）直到平台期，受引物、dNTP反应原料消耗、PCR扩增效率及DNA聚合酶种类和活性及非特异性产物的竟争等因素影响。3、PCR扩增产物的分析。PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定。1）凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致。2）酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，还能进行变异性研究。3）分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。4）核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法4、实时荧光定量PCR：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。如：核酸染料技术：SYBRGreenI(SGI)；荧光探针技术：TaqManprobe。在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念--Ct阈限循环值；1）Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。电泳（根据PPT所给重点）电泳：是指带电粒子在电场中向与自身所带电荷相反的电极移动的现象电泳分离技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术电渗：液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。当方向一致时，电泳速度=理论速度+电渗，反之电泳速度=理论速度—电渗不连续凝胶电泳：不连续凝胶电泳是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力(有浓缩效应)。脉冲场凝胶电泳PFGE电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。影响因素：脉冲时间，电压，电场夹角，温度。一、影响电泳的主要因素有哪些？（一）颗粒自身因素迁移率与颗粒表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。（二）影响电泳速度的外界因素1.电场强度电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。2.溶液的pH值溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，决定了物质所带净电荷的量和性质。3.溶液的离子强度离子氛现象降低该粒子的迁移率4.电渗现象液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。5.温度的影响电泳因通电产生叫焦耳热，温度升高，迁移率增加6.支持物的影响支持物要求均匀，吸附力小二、如何制备聚丙烯酰胺凝胶？将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水(约3–4mm)，用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60min凝胶完全聚合，则可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界线。将上、下贮槽的蒸馏水倒去，将混合均匀后的浓缩胶溶液，用细长头的滴管加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，距短玻璃上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置电泳槽，10min左右，上胶即可聚合，再放置10-20min，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。三、不连续电泳样品压缩成层原理？1、缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩。2、凝胶孔径的不连续性：在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理？SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳：（SDS-PAGE）蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率取决于:所带净电荷、分子的大小、形状等因素。加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate,简称SDS)，则电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。原理：加入SDS和巯基乙醇后:巯基乙醇使Proteins二硫键还原SDS使氢键、疏水键打开，并结合到Proteins分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于P分子量五、采用电泳技术如何测定蛋白质分子量？如何测定蛋白质等电点？1测蛋白质分子量应用SDS-PAGE。蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子的大小、分子形状和所带电荷的多少。SDS（十二烷基磺酸钠）是一种去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS后，SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的强负电荷，并且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的带电荷量和分子形状的差异。这样电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大小，蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子质量的对数成直线关系。以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，得到标准曲线，根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子质量。2测蛋白质等电点可用等电聚焦电泳。在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。PS.等电聚焦电泳（IEF，isoelectricfocusingelectrophoresis）利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。杂交（hydridization）（只出名解）1、杂交：指两个以上的分子因具有相近的化学性质(或结构互补)而在适宜的条件下特异地相互识别、结合形成杂交体（hybrid）的过程。2、核酸分子杂交：是在DNA变性和复性的基础上建立起来的一种分子生物学技术.其原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下根据碱基互补的原则可以形成双链(碱基对之间非共价健形成稳定的双链).特点：高度特异性和高度灵敏性。广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量定性分析，基因突变的检测等。1）DNA变性：DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团样DNA，称为DNA变性。变性方法：1):加热、2):DNA溶液的pH改变、3):有机溶剂等变性的DNA的特征：粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫外吸收增加。2）DNA复性：变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。3、核酸探针：是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记而便于检测的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。分为基因组DNA探针；cDNA探针；寡核苷酸探针；RNA探针等。1）基因组DNA探针：DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针种类很多:有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。源：分子克隆、PCR。2)cDNA探针：cDNA（complementaryDNA）探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。无内含子和非编码序列，cDNA探针是目前应用最为广泛理想的一种探针。来源：分子克隆、RT-PCR。3)RNA探针：单链分子，分子内无高度重复序列，RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高,特异性强。但易水解，标记困难。4)寡核苷酸探针：根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，亦可作为探针使用。若不知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸顺序推倒出核酸顺序，但要考虑到密码子的兼并性。多用于克隆筛选和点突变分析。4、核酸分子杂交方法1）固相杂交:将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中，支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。优点:1):未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，2):膜上留下的杂交物容易检测,3):能防止靶DNA自我复性等。常用类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。2）液相杂交:参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。核糖核酸酶保护分析（RibonucleaseProtectionAssay，RPA）等5、Southern印迹杂交DNA+DNA杂交，即将待测DNA酶切、电泳、转移（印）并固定在固相支持物上，用已知DNA探针进行检测的方法。用途：1):基因定性定量2):DNA物理图谱3):基因变异重排4):基因限制性内切酶酶切片段长度多态性分析（RFLP）5):疾病诊断6、Northern印迹杂交（Northernblotting）RNA+DNA/RNA杂交，这是一种将待测RNA从琼脂糖凝胶中转印并固定到膜上、然后再与已知的DNA或RNA探针杂交的方法。用途：1):基因表达(mRNA)定性定量2):转录产物特性分析。7、核糖核酸酶保护分析（RibonucleaseProtectionAssay，RPA）是一种高通量，各项指标均优于传统NorthernBloting的mRNA定量检测技术。利用32P-（放射法）或生物素（非放法）标记多个长短不一的反义RNA探针，将含过量探针的溶液与样品总RNA杂交，经核糖核酸酶（RNase）降解未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针，待测RNA则因与探针结合形成双链而被‘保护’，则杂交双链RNA的量