分子生物学课件7DNAtech

第七章DNA重组技术recombinantDNAtechnique•基因工程geneticengineering•遗传工程geneticengineering•基因操作genemanipulation•DNA重组技术recombinantDNAtechnique•基因克隆genecloning•分子克隆molecularcloning基因工程：外源DNA，通过具有复制能力的载体分子形成重组DNA分子，导入受体细胞，进行持久稳定的复制和表达，使受体细胞产生外源DNA或蛋白质。基因工程的理论依据：遗传物质——DNADNA双螺旋结构模型操纵子学说基因的表达与突变（中心法则）基因工程的工具酶的发现基因工程的基本程序：分—切—接—转—筛基因工程技术的特点：1.可在体外人工的,有目的的,根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复；2.方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。基因工程的基本程序•1972年，美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV40DNA、噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。•1973年，美国斯坦福大学的Cohen和Boyer等人在体外构建出含有四环素和链霉素两个抗性基因的重组质粒分子，将之导入大肠杆菌后，重组质粒得以稳定复制，并赋予受体细胞抗性，由此宣告了基因工程的诞生。基因工程大事记•1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物•1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用•1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼中科院水生生物研究所培育的转基因鲤鱼，表现出快速生长效应。•1993基因工程西红柿在美国上市•1997多莉羊英国爱丁堡罗斯林研究所•1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%•2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图•2001.2.11公布人类基因组基本信息•生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、发酵工程克隆羊多利（Dolly）的诞生•1997年12月，英国Roslin研究所克隆羊多利（Dolly）的诞生揭示一个全新概念：由成年机体的一个体细胞核，可以复制一个基因完全相同的新生命个体。•克隆鼠、克隆牛等实验的成功进一步验证了其科学性将体细胞核移植去核卵细胞形成的克隆细胞，其基因组DNA与细胞核供体一致，由克隆细胞复制出可供移植、无免疫排斥的各种组织细胞、器官，是21世纪生命科学的一个新里程碑。*组织纤溶酶原激活剂*生长激素*促生长素*抗血友病因子Ⅷ*脱氧核糖核酸酶*葡糖脑苷脂酶*鼠单克隆抗体*胰岛素*人生长激素*干扰素*白细胞介素2*粒细胞集落刺激因子*粒细胞巨噬细胞集落刺激因子*红细胞生成素EPO基因工程的主要技术•DNA、RNA的分离纯化•凝胶电泳技术•PCR•酶切及鉴定、DNA重组连接•DNA测序、DNA合成技术•分子杂交•微生物的培养、保存•克隆（clone）无性繁殖名词：从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。动词：•基因克隆–应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。•基因克隆示意图载体DNA(限制性内切酶切开)目的基因＋宿主细胞＋重组体已转化的宿主细胞阳性克隆株繁殖表达自然界的基因转移和重组•基因重组(geneticrecombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译•自然界的基因转移和重组是无目的的•基因工程有目的•结合作用–质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）。•转化作用transformation–通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程。基因工程•工具酶•载体•重组DNA技术的基本过程•基因的克隆和分离•文库的构建•克隆基因的表达工具酶限制性核酸内切酶切割双链DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)•识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键•分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型•命名：–EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)•识别和切割位点–回文结构4～6bp–出现两种末端*粘性末端粘端*平头末端平端•同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点•同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端粘性末端与平头末端EcoRⅠGAATTCCTTAAG5′3′5′3′5′GCTTAAAATTCG3′3′5′粘性末端SmaⅠCCCGGGGGGCCC5′3′3′5′5′CCCGGGGGGCCC3′3′5′平头末端•DNA聚合酶Ⅰ•逆转录酶(reversetranscriptase)•T4DNA连接酶(T4ligase)•碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)•末端脱氧核苷酰转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)•TaqDNA聚合酶修饰酶DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性•5′至3′的聚合活性–5′→3′方向•核酸外切酶活性–5′→3′外切酶活性–3′→5′外切酶活性•polⅠ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段–大片段（Klenow片段）：聚合活性、3′→5′外切活性常用的工具酶核酸外切酶活性•3′→5′外切酶活性•5′→3′外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性′′′′5335DNA连接酶碱性磷酸酶的脱磷酸作用末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)载体vector•DNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达•克隆载体、表达载体–原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13）等–真核载体：动物病毒载体pLXSN等载体的基本要求：1.复制单位;2.克隆位点(多个单克隆位点);3.筛选标记;4.分子量尽可能小;5.外源DNA插入后不影响载体本身的复制.没有一个天然的DNA完全符合载体条件,故使用时需进行改造.质粒plasmidλ-噬菌体λ-phageM13柯斯质粒cosmid常用的克隆载体：•质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子——理想的质粒*拷贝数多;*两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)筛选标志*多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiplecloningsites,MCS)*大小2~10kb；*优点：易于操作、保存；*缺点：转化效率较低，一般106-7clone/1ug转化方法：化学法电转*应用：1.小基因组的克隆2.单一序列的克隆(目的基因的克隆)pBR系列来源于Psc101、colE1和RSF2124三个天然质粒改造重组而成，pBR322是应用最多的大肠杆菌质粒载体，用氯霉素扩增法可使质粒DNA占细胞DNA总量的50%，这对制备大量质粒DNA极为有利。常用的质粒载体四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因OriPstⅠSalⅠPvuⅡAvaⅠBamHⅠHindⅢEcoRⅠpBR322(ampr)(terr)常用的质粒载体pUC系列pUC系列质粒（pUC8、9、12、13、18、19）具有pBR和M13的许多特性，一般2.7kb.含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。常用的质粒载体筛选指示系统—蓝白斑筛选在培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）和底物x-gal，IPTG诱导LacZ表达产生ß-半乳糖苷酶，使x-gal水解，产生兰色化合物，形成兰色菌落；当插入外源片段，使LacZ基因失活，形成无色菌斑。IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)常用的克隆载体——噬菌体•λ噬菌体(λphage)–外源DNA：9~23kb–常用：EMBL系列、λgt系列、charon系列•粘性质粒(cosmid)：λDNA的cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：40~50kb•M13噬菌体λ噬菌体(λphage)特点：一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型为双链线状DNA分子，长度48.5kb,分子两端各有一个12bp组成的粘性末端,感染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补连接成环,连接处称COS位点。1.本身有复制体系;2.中间(J-N间)是λ生长非必需区,可被其它外源DNA取代;3.λDNA在体外可包装成病毒颗粒,感染效率高;4.载体容量大,可装入大片段外源DNA(20kb);5.可人工加入多克隆位点;6.筛选容易——噬菌斑筛选;7.主要用于DNA文库构建.插入型载体——含单一的限制性酶切位点，可接受10kb以下的外源片段，可用于cDNA文库构建；取代型载体——含某一限制性酶的两个切点，可接受20kb左右的外源片段，可用于基因组DNA文库构建。将基因组片段克隆进lambda置换型载体的基本方法粘性质粒(cosmid)是一种人工改造的载体,双链环状DNA，λDNA的cos区+质粒，克隆容量：40~50kb1.λ-DNA的COS位点及控制包装的序列;2.质粒的复制起点和抗药性标记(Ampr);3.多种单一的酶切位点.cos:cohesive-endsite特点：cosmid较小,约4–6kb,可容纳40-45kb的外源DNA,重组体可象噬菌体一样进行外壳装配,形成噬菌体颗粒,感染大肠杆菌效率比质粒高得多,进入宿主细胞后,只能象质粒一样扩增,并依赖抗药性被筛选.粘性质粒(Cosmid)优缺点:1.克隆效率高;2.可利用质粒DNA的方式扩增;3.可克隆较大DNA片段;主要用于真核基因的克隆,基因组文库构建4.缺点:产生串联现象。M13噬菌体一种丝状单链噬菌体，闭环正链ssDNA，全长6.5kb,感染大肠杆菌后,ssDNA转变为dsDNA,可用作克隆载体.最大优点：产生单链DNA,可制备单链DNA探针、DNA序列分析及DNA的点突变.RFDNA:replicationalformDNAYAC载体（yeastartificialchromosome）酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达200kb-1000kb，含有酵母第4号染色体的着丝粒CEN4、自主复制序列ARS1和作为端粒的Tel序列，选择性标志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组DNA文库构建。一个典型的YAC系列载体YAC克隆的基本过程BAC（bacterialartificialchromosome）——细菌人工染色体基于大肠杆菌的F质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体。每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子）的严谨型控制的复制子oriS，一个RepE以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA,parB,和parC），可容纳外源基因片段长达300kb以上，常用于大的染色体基因组DNA文库构建。表达载体(expressingvector)•特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列•大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号–启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子–核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列–转录终止序列表达载体包括的元件pET11c表达载体pT7-7表达载体哺乳动物表达载体•真核表达元件：启动子/增强子—克隆位点—终止信号和加poly(A)信号克隆技术•克隆来源与英语“clone”或“clonin