分子遗传学综述作业

视网膜母细胞瘤研究进展姓名：学号：学院：医学院[摘要]视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma，Rb）是一种起源于视网膜胚胎性核层细胞的恶性肿瘤，通常发生于5岁之前的儿童。Rb由位于13q14.1-q14.2RB1区Rb1基因突变引起，其发生率约为1:15000，在新生儿中约为1:20000,我国每年新发患儿数在1100-1500例左右。临床上Rb以白瞳症、斜视、青光眼、眼眶蜂窝织炎、葡萄膜炎、前房出血、玻璃体出血等为特征；临床治疗Rb以眼球摘除术、化学疗法、温热疗法、放射疗法和基因疗法为主。本文结合最新的研究进展，对Rb的临床特征、发病机理、检测方法和治疗方法等方面，进行以下综述。[关键词]Rb；Rb1；临床特征；发病机理；检测；治疗1概述1.1分类与研究现状Rb通常按3种不同的方式：家族性或散发性、单侧或双侧、遗传性或非遗传性进行分类[1]。临床上我们倾向于使用前两种分类法[2]。因此,Rb临床病例可分别归类为单侧散发性、双侧散发性、单侧家族性及双侧家族性。Rb患者中，约60%的患者为单侧，平均诊断年龄为24个月。单侧患者的RB肿瘤通常为单病灶，少数为多灶性肿瘤（单侧多发性Rb）。大多数人的单侧Rb无家族史，肿瘤较大，有时不能确定是否是一个单一的肿瘤。约40%的患者有双侧RB，平均诊断年龄为15个月。初步诊断时，两只眼睛均受累。双侧Rb患者表现为多肿瘤灶，有些孩子最初诊断为单侧RB也可发展为双侧RB。极少数情况下，双侧Rb和松果体母细胞瘤同时发生称为三侧Rb，且通常致死。发生Rb后，其他特异性的眼外原发肿瘤的发生风险增加（统称为继发性肿瘤）。大部分的继发性肿瘤为骨肉瘤、软组织肉瘤（大多数为肉瘤和横纹肌肉瘤）或黑色素瘤[3]。这些肿瘤通常在青春期或成年期出现。在接受外放射治疗的RB患者中，继发性肿瘤的发病率会增加50%[4]。即使没有暴露于高剂量的放疗的遗传性视网膜母细胞瘤幸存者一生发展的迟发性癌的风险也会增加[5]。我国Rb的临床和基础研究一直是眼科学重点探索的研究课题之一，近15年国家自然科学基金资助项目，仅Rb研究课题就有11项。其研究不仅从染色体和分子水平证明了Rb基因的异常[6]，建立了多个Rb瘤细胞系[7]，制备Rb单克隆抗体和开展了Rb的免疫导向和基因治疗等实验性研究[8]；更重要的是在我国形成了多个以Rb为研究的团队，近20年国内各期刊发表的Rb有关文章共531篇，其中临床研究314篇（59.31%），基础研究217篇（40.87%），其内容广泛且有深度1.2临床特征Rb是一种通常发生于小于5岁的儿童的视网膜的恶性肿瘤。RB来源于具有癌症突变倾向的细胞，这些细胞均含有RB1基因的重复序列。Rb呈单灶或多灶分布，大约60%患者的RB1基因来源于单系，平均诊断年龄为24个月；另外40%患者的RB1基因来源于双系，平均诊断年龄为15个月。遗传性的RB是一种常染色体RB易感疾病，患有遗传性的RB个体患其它非眼部的肿瘤的风险也会增加。1.3临床描述视网膜母细胞瘤（Rb）。最常见的症状是一种白色瞳孔反射（白瞳症）。斜视是第二个最常见的症状，可能伴随或之前的白瞳症。不正常的症状还包括青光眼、眼眶蜂窝织炎、葡萄膜炎、前房出血、玻璃体出血。大多数患病儿童在5岁以前可被诊断。非典型表现更常见于年龄较大的儿童。RB患者通常有下列临床表现：阴性家族史和单侧RB（60%患者）；阴性家族史及双侧Rb（30%患者）；阳性家族史、单侧或双侧Rb（约10%患者）。对于具有积极家族史的人进行临床监测，通过串行视网膜检查，肿瘤往往被确定在出生后的第一个月。另外，高达5%具有单病灶Rb的患者和7.5%具有多灶性Rb的患者存在13q14缺失现象。这种染色体异常往往与发育延迟和出生缺陷相关[9]。基因型与表型的相关性：在大多数有遗传性Rb家庭中，遗传性的种系致病性变异在双侧中发展为多发性肿瘤。然而，在家庭中有Rb的第一人只有单侧RB，大多数这种隔离Rb1无效等位基因是通过移码突变或无义突变而改变的。但在一些些特定情况下，Rb1无效等位基因几乎完全外显（＞99%）[10]。少于10%的家庭表现出低外显率（即增加单侧RB患病率）和不完全外显率（≤25%）。这种低外显率的表型通常与错义突变导致的RB1等位基因突变、不同的剪接位点的变异、1号外显子缺失突变或启动子区域的致病性突变相关。1/3的家庭显示不同的外显率取决于致病等位基因的亲本来源（亲源效应）[11]。细胞遗传学可见缺失涉及13q14，也导致在相同的染色体区域的Rb1基因缺失会导致发育迟缓[12]和轻度至中度面部畸形。由于大面积的13q14缺失会使基因表达减少，相当比例的这种缺失的个体仅表现单侧RB；有些孩子甚至不发生肿瘤[13]。位于着丝粒部位并与Rb1相邻的MED4连续的损失，解释包括Rb1和MED4等基因在内的大的缺失导致表达减少的原因[14]。1.4诊断/检测Rb通常可经间接检眼镜检查眼底进行诊断。成像研究可以用来支持肿瘤诊断和临床分期。遗传性视网膜母细胞瘤的诊断是建立在RB1基因种系致病性突变的Rb原发病患者或Rb家族。1.4.1提示性发现：当出现白瞳症（白瞳）、斜视、改变眼睛的外观、视力减退等症状，怀疑为视网膜母细胞瘤患者。当出现任何具有视网膜母细胞瘤的诊断结果，包括单侧（单发和多发性）和双侧受累、个人患有视网膜瘤和有视网膜母细胞瘤家族病史时，应怀疑为遗传性视网膜母细胞瘤的个体。1.4.2建立诊断在全瞳孔扩张或验光的基础上，麻醉状态下，通过检查视网膜以确诊和确定疾病的程度。眼部影像有助于确诊，不需要病理诊断。遗传性视网膜母细胞瘤的诊断是建立在一个家系中的视网膜母细胞瘤（Rb）或视网膜瘤的原发病患者和家族历史性的Rb基础之上的。Rb患者多数没有家族史，因此，为识别一个杂合子Rb1致病性变异，在分子遗传学检测前必须确定遗传的Rb是否是原发病例，允许早期诊断和筛查高危Rb的亲属。分子生物学确定与遗传性视网膜母细胞瘤个体的检测方法包括单基因检测和多基因谱检测。其中单基因检测包括①双系、单系遗传，或单侧多发RB的患者的检测：RB1基因序列分析和靶向删除/重复分析外周血DNA。②单系、单发的Rb和家族史阴性的患者的检测：如果肿瘤组织不可用，可通过外周血DNA序列对Rb1进行序列分析和基因缺失/重复分析；如果肿瘤组织可用，通过肿瘤DNA对Rb1进行序列分析和基因缺失/重复分析。包括Rb1基因再能的多基因谱也可考虑用于检测，但由于没有遗传性视网膜母细胞瘤的位点多样性，对分析数据评价局限于Rb1的突变。1.4.3鉴别诊断幼年时期的几种视觉条件与视网膜母细胞瘤的临床症状相似，包括：散发性先天性疾病包括持续的原始玻璃体增生症和渗出性网膜病（OMIM300216）。遗传性疾病包括结节性硬化症，诺里病、色素失控症、家族性渗出性玻璃体视网膜病变（见于常染色体显性遗传的家族性渗出性玻璃体视网膜病变）和希佩尔-林道病、眼部感染犬弓首蛔虫等。1.4.4治疗治疗的目标是先保存生命，然后是视力。作为最佳的治疗可能是复杂的，RB的治疗方法来自各个领域包括眼科，小儿肿瘤治疗技术专家，病理学和放射肿瘤学协作，可提供优化的服务。除了眼睛的分级与肿瘤分期，治疗方案的选择取决于许多因素，包括肿瘤病灶的数目（单发、单侧多发，双侧）、定位和眼内肿瘤大小、有用的视觉潜力，眼外蔓延的程度和可利用的资源等。对于眼睛的治疗方法的选择包括摘除术、冷冻疗法、激光疗法、系统疗法、或局部化疗包括动脉化疗联合眼内激光或冷冻治疗或紧随其后、巩膜斑块放疗以及作为最后的手段—放疗。如果可能的话，任何辐射（包括X射线、CT扫描、和外部束辐射）应避免以减少迟发性继发癌症的终生风险。这些治疗方法只用于必要的情况之下。1.5管理1.5.1治疗表现早期诊断和治疗可以降低Rb和非眼部肿瘤的发病率并延长寿命；护理最好由包括眼科、多学科小组的儿科肿瘤学、病理学、放射肿瘤学方面的专家提供。治疗方法的选择取决于肿瘤分期、肿瘤病灶数目（单发、单侧多发，双侧）、定位和眼部肿瘤大小，玻璃体状况，可用视觉的潜力，眼外扩展程度，可利用的资源。治疗方案包括摘除术；冷冻疗法；激光疗法，或配合局部化疗包括动脉化疗联合眼内激光或冷冻治疗；巩膜斑块放疗；放疗作为最后的治疗手段。1.5.2激发癌症的预防辐射（包括X射线、CT扫描、和外部束辐射）在遗传性Rb个体中应尽量避免使用，以降低迟发性继发癌症的风险。1.5.3监测在含有Rb1基因致病性突变的儿童中：眼麻醉下每3-4周检查一次，直到6个月大，然后以低于该频率进行检查，直到3岁。每3-6个月对合作儿童进行临床检查，直到7岁，然后每年或每半年检查一次。患有单侧RB但没有确定的杂合子Rb1致病性变异个体具有低水平的嵌合体的风险，应该对眼睛进行包括超声在内的常规临床检查。患有视网膜瘤（与RB相关的视网膜癌前病变）的个体应每1-2年进行一次视网膜检查和影像检查。应检测视网膜母细胞瘤患者的继发性的非眼部肿瘤，医生应及时对发生的骨疼痛或肿块进行评估，因为具有肉瘤和其他癌症的高风险；但有效的筛查方案尚未开发。1.5.4风险评估亲属家庭中无症状的高危儿童的早期识别分子遗传学检测可减少这些高危家庭成员中没有遗传致病变异个体所需的昂贵的筛选程序的费用。评估内容包括：①分子遗传学检测：如果家庭中的致病性变异是已知的，可以减少那些有风险但没有遗传致病变异体的家庭成员的昂贵的程序费用。②眼部检查：在出生后通过一位有经验的眼科医生对RB进行上述检查（见监控，经初步诊断后Rb检测。年轻的或不合作的儿童可能需要麻醉下检查。③遗传咨询的目的为高危亲属组织相关性的检测。2Rb1基因视网膜母细胞瘤基因1(Retinoblastoma1，Rb1)是人类第一个分离克隆的抑癌基因，因为该基因与视网膜母细胞瘤的发生密切相关，因此被命名为视网膜母细胞瘤基因。Kundson等[15]对视网膜母细胞瘤的遗传机理进行研究，提出了著名的“两阶段突变假说”，发现该肿瘤的形成需要13q14一对等位基因的同时缺失或失活。基于此假说，Friend等[16]成功克隆了人的一段位于13q14的序列，此段序列上有一段长约70kb的cDNA片段，而在视网膜母细胞瘤和骨肉瘤中此cDNA片段缺失：Lee等[17]对这段序列的RNA进行测序并预测蛋白质序列，发现此段序列的mRNA长约4.6kb，蛋白质大约包含816个氨基酸残基，而且发现此氨基酸序列有与核酸结合蛋白类似的结构域；Fung等[18]利用H3-8探针在13q14区域上也分离获得了两段相似序列的cDNA克隆：RB1和RB2。关于RB细胞的组织来源问题争论已久，Verhoeff等[19]1926年就提出RB起源于视网膜原始胚胎细胞的观点，但当时未引起重视。若肿瘤起源于成熟视网膜的一些功能细胞，则该肿瘤的形成应是一去分化的过程；若肿瘤起源于未分化的干细胞，则细胞分化的过程被阻断、停滞，肿瘤的发生是不能分化所致。RB发生的起始原因是舶基因的两次突变而失活。20世纪80年代中期将舶基因定位于13号染色体长臂l区4带，并成功地从分子水平分离和克隆出Rb基因。2.1Rb基因结构与产物Rb基因由27个外显子经转录和剪接形成4.7-kb大小的mRNA，无选择性剪接功能。Rb1基因编码一种广泛表达的核蛋白，参与细胞周期调控（G1期向S期过渡）。Rb可被细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）磷酸化，然后进入S期。一旦磷酸化，结构域失活，导致细胞蛋白的释放[20]。病理性突变的Rb1导致表达的蛋白失去调节细胞周期的功能。而造成低外显率的RB的病理性突变中，部分Rb1的活性会有所保留[21]。2.2Rb1分子遗传病机除了非常罕见的例外情况，肿瘤的发展是从没有正常的RB1基因的细胞开始[]。RB的发生开始于一对Rb1等位基因均发生突变。包括：①良性等位基因变异：在2.7kb的开放阅读框内无频繁的多态性位点突变，但有内含子突变，两个高度多态性微卫星（Rb1.20，Rbi2），和一个小卫星（RBD）。②致病等位基因变异：超过2500个核苷酸突变已在视网膜母细胞瘤或肿瘤的人血白细胞DNA中观