分子遗传要点总结

第一章1.理解Genomes,Transcriptomes和Proteomes三个名词，并阐明它们在基因组表达过程中是如何联系在一起的；基因组是地球上每一物种具有的生物学信息的存储库。指生物的整套染色体所含有的全部DNA或RNA序列。转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。蛋白质组，即细胞中那些决定细胞能够进行生化反应的所有蛋白质组分2.理解基因由DNA（或RNA）组成的三个实验；掌握双螺旋结构的关键特征；①肺炎双球菌的转化试验；②噬菌体感染实验；③烟草花叶病毒的感染实验。重点：DNA分子通常以右手双螺旋形式存在，两条核苷酸链反向平行，且互为互补链。戊糖－磷酸骨架在分子的外铡，在分子表面形成大沟和小沟，碱基堆积于螺旋内部.碱基间通过氢键相互连接，A和T以2个氢键配对，G和C以3个氢键配对.螺旋中相邻碱基间相隔0.34nm，每10个碱基对螺旋上升一圈，螺距为3.4nm，直径为2.37nm。3.正确区分编码RNA和功能性RNA；描述蛋白质结构的不同层次；描述遗传密码的关键特征；a.一级结构：氨基酸通过肽键连接成一条多肽链。b.二级结构：指多肽采取的不同构象，由不同氨基酸之间形成的氢键所稳定。c.三级结构：将多肽链的二级结构组分折叠成为三维构型而形成的。d.四级结构：两条或更多已形成三级结构的多肽链组合在一起形成一个多亚基蛋白质。1）每个密码子三联体(triplet)决定一种氨基酸；2)即密码子无逗号;3)密码子具有方向性，例如AUC是Ile的密码子，A为5'端碱基，C为3'端碱基。因此密码也具有方向性，即mRNA从5'端到3'端的核苷酸排列顺序就决定了多肽链中从N端到C端的氨基酸排列顺序;4)密码子有简并性(degeneracy)一种氨基酸有几个密码子，或者几个密码子代表一种氨基酸的现象称为密码子的简并性。5)共有64个密码子，其中AUG不仅是Met或者fMet(在原核细胞)的密码子，也是肽链合成的起始信号，故称AUG为起始密码子。UAA、UAG和UGA为终止密码子，不代表任何氨基酸，也称为无意义密码子。6)密码子有通用性，即不论是病毒、原核生物还是真核生物密码子的含义都是相同的。4.掌握转录组学和蛋白质组学的一般研究方法，特别是SAGE技术、微阵列和基因芯片技术以及鉴定蛋白质相互作用的技术（噬菌体展示、酵母双杂交等）。基因表达系列分析（SAGE）SAGE技术不是研究完整的cDNA，它产生长度12bp的短序列，每一条都代表了转录组中存在的一种mRNA。切下来的片段被收集起来，头尾相连以产生一个串联体，进行测序分析。串联体中的各个标签序列信息被读取并与基因组中的基因序列比对，从而可以分析哪些基因被转录，表达水平如何。DNA微阵列技术（microarray）指在固体表面（玻璃片或尼龙膜）上固定成千上万DNA克隆片段，人工合成的寡核苷酸片段，用荧光或其他标记的mRNA,cDNA或基因组DNA探针进行杂交，从而同时快速检测多个基因表达状况或发现新基因，快速检测DNA序列突变，绘制SNP遗传连锁图，进行DNA序列分析等的一种新技术。基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析。噬菌体展示技术：是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。酵母双杂交:激活因子（转录因子）：一类控制基因表达的蛋白质，包含DNA结合结构域和转录激活结构域。双杂交系统使用缺乏某一报告基因相应激活因子的酿酒酵母菌株，此时报告基因是不表达的。第二章1.DNA重组研究中所使用的不同类型酶的活性及主要作用末端修饰酶：改变DNA分子末端，为连接实验的设计增加可操作空间。DNA聚合酶：以现有DNA或RNA分子为模板合成DNA的酶DNA连接酶:通过DNA连接酶可以将限制性内切核酸酶消化产生的DNA片段重新连接起来，或者连接到一个新的分子上。碱性磷酸酶:去掉DNA分子5’端磷酸基团，从而阻止这些分子连接到其他分子上末端脱氧核糖核苷酸转移酶：属于模板非依赖的DNA聚合酶。2.明确DNA聚合酶的重要特征，区分基因组研究中所使用的各种DNA聚合酶；3.说明限制性内切酶切割DNA的方式；区分平端与粘端连接，并说明如何提高平端连接的效率限制性内切核酸酶在特定的位置切割DNA分子，识别序列具有180度旋转对称的回文结构.a.I和III型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的降解，但切割位置不固定。b.II型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的降解（无修饰酶活性），且具有识别位点的专一性和切割位点的专一性，一般在识别序列内切割，不需要ATP提供能量，是重组DNA技术中常用的限制性内切酶。平端：是通过限制性内切酶酶切后出现的片段末端是整齐配对的，这样再进行连接效率比较低。粘端：限制酶切后在末端出现两条带不一样长，这样就出现一个小尾巴，叫做粘性末端，再连接时，只要粘性末端配对互补就可以连上。提高平端连接的效率两条途径a.一种方法是将称为连接子（linker）或接头（adaptor）的小双链分子连接到钝末端。b.另一种方法是利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶进行同聚物加尾，即在钝末端的3’末尾一个接一个地添加核苷酸。4.详述克隆载体的主要特征；列举用于克隆长片段DNA的载体，并评价每种载体的优缺点1.它们都含有复制起始位点2.能够自我复制3.在原核生物中有表达的选择标记基因4.具有多克隆位点。a.考斯质粒（cosmid）：具有cos位点的质粒，与噬菌体一样具有感染性，插入片段可高达44kbb.酵母人工染色体（YAC）：在YAC中，构成这些染色体组件的DNA序列与一个或多个选择性标记物，至少一个限制性酶切位点连接起来，酶切位点是为了插入新的DNA，可用来克隆600-1400kb的片段。缺点：一些类型的YAC载体有插入不稳定的问题，即克隆的DNA重排形成新的序列组合c.细菌人工染色体（BAC）：是基于天然的大肠杆菌F质粒构建的，能够克隆300kb及更长的片段，并且插入的片段很稳定；可以通过Lac筛选来鉴定重组体，是目前克隆大片段DNA最常用的载体。d.细菌噬菌体P1载体:与载体相似，以天然噬菌体基因组的缺失形式为基础；P1基因组比基因组大，因此能克隆的DNA片段比载体大；运用目前的技术可以克隆长达125kb的片段.e.P1衍生的人工染色体（PAC）:综合了P1载体和BAC的特点，具有克隆长达300kb片段的容量f.Fosmids:包含F质粒的复制起始位点和载体的cos位点，有出现不稳定问题的倾向5.描述如何进行PCR反应。第三章1．名词解释遗传图谱：指应用遗传学技术（遗传重组）构建的能在基因组上显示基因和其它序列特征位置的线性排列图，反映了基因或标记间的相对距离和顺序。cM物理图谱：指应用分子生物学技术直接分析DNA分子，从而构建的能显示包括基因在内的序列特征位置的图谱，它反映了基因或标记间的实际距离。bp，kb，Mb2.描述用于构建遗传图谱的分子标记，以及每种标记是如何检测的A.限制性片段长度多态性（RFLP）用限制性内切酶酶切基因组DNA时，在同一种生物的不同个体间出现含同源序列的酶切片段长度的差异。可用southern杂交，PCR检测。B.简单重复序列(微卫星)指重复单位相对较小（2-6bp的基序），由于重复单位数目的变化而形成的多态性。PCR+平板PAGE电泳和PCR+毛细管电泳检测。C.单核苷酸多态性（SNP）基因组中的某些位点上，有些个体只有一个核苷酸与其它个体不同，这种分散在基因组中的单个碱基的差异就称为SNP。a通过寡核苷酸杂交分析检测SNP包括(1)DNA芯片技术(2)液相杂交技术b.通过耐扩增突变系统检测SNP3描述用于遗传作图的群体，以及它们是如何构建的用于遗传作图群体有暂时性分离群体包括F2和回交群体，永久性分离群体包括RIL,DH4掌握构建物理图谱的三种方法，特别是限制酶切图谱的构建方法和STS图谱的构建方法，并评价三种方法的优缺点物理作图的常用方法：1.限制性作图：在DNA分子上定位限制性内切酶酶切位点的相对位置；双酶解（doubledigest）Key：分析重叠片段部分酶解+完全酶解：比较分析这两种情况下的片段大小。末端标记+部分酶解:A利用放射性的同位素标记DNA的3’端或5’端B部分酶解C放射自显影限制性作图适用于小分子。2.荧光原位杂交（FISH）：将分子标记与完整染色体杂交来确定标记的位置；中期染色体是高度凝聚的，每条染色体都具有可识别的形态。使用中期染色体的缺点在于，由于它的高度浓缩的性质，只能进行低分辨率作图，两个标记间至少相隔1Mb才能分辨出来。因此，中期染色体FISH主要用于确定新标记在染色体上的大概位置，为更精细的作图做准备。操作较繁琐，数据积累速度太慢。3.序列标签位点（STS）作图：通过对批量的基因组片段进行PCR和（或）杂交分析，来对短序列进行定位作图。一个DNA序列要成为STS，要满足两个条件：它的序列必须是已知的，以便于用PCR方法检测该STS在不同DNA片段中存在与否；STS必须在拟研究的染色体或基因组上有唯一的定位。因此，需要确保STS不位于重复DNA区域。STS作图必需的第二个要素是覆盖拟研究的染色体或基因组5倍以上的DNA片段群.5描述放射杂交体是如何产生的？放射杂交体：利用高剂量的射线将供体细胞染色体打断成若干小片段，再与近缘物种的受体细胞融合，形成放射杂交体.第四章1.掌握链终止DNA测序法基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开。链终止法测序的起始材料是均一的单链DNA分子。首先由短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，并充当引物合成与模板互补的新DNA链。在测序反应体系中加入少量的被不同荧光标记物标记的双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）后，合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生一系列只差一个核苷酸的DNA分子。通过PAGE电泳可以读出待测DNA分子的序列。2.描述化学降解法及其应用；掌握鸟枪法、全基因组鸟枪法和克隆重叠群法等基因组测序方法及其优缺点化学降解法也是通过检查末端核苷酸已知的分子长度来确定序列的。这些不同长度的分子是通过能在特定的核苷酸处进行特异切割的化学试剂的处理而产生的。利用化学降解法测序，至少需要进行4个单独的测序反应，每种核苷酸对应一个反应。起始材料是双链DNA。每条链的5’端连接一个放射性的磷基团对DNA进行标记。双链中的一条链可能比另一条链含有更多的嘌呤核苷酸，因此就稍微重一些，电泳过程中就迁移的慢。从凝胶中纯化出一条链后，分成4份样品，每份样品都用一种切割试剂进行处理。每个反应所产生的分子上样到PAGE平板凝胶的一个泳道上，电泳后条带在凝胶上的位置通过放射自显影来观察。移动最远的条带代表最小的DNA片段。鸟枪法：测序实验中得到的短序列可通过检查重叠区而直接叠加成主要序列鸟枪法的优点在于测序速度快，并且能够在遗传图谱和物理图谱不存在的情况下进行工作。用克隆重叠群方法组装序列：在该方法中，基因组通常经部分酶切而产生较长的DNA片段，再把这些片段克隆到高容量载体，如BAC中。借助基因组图谱的信息，建立BAC克隆重叠群，然后通过鸟枪法对克隆群进行分别测序再组装。可以通过染色体步移来建立克隆重叠群，但该方法费力全基因组鸟枪法测序：鸟枪法测序中最费时的地方是将单个序列重叠群通过封闭序列间隙和物理间隙而连在一起的阶段。通过使用两种或两种以上的不同载体中所克隆的片段产生的序列能够有效提高基因组的整体覆盖面。部分问题是序列产生的随机性，基因组的某些部分被微小片段覆盖许多次，而其他部分只被覆盖一两次3.说明利用鸟枪法进行基因组测序如何保证所获序列的准确性和完整性物理间隙：指克隆文库中不存在的序列，可能是因为这些序列在所使用的克隆载体中不稳定造成的。两种解决策略：a.用噬菌体载体重新构建一个克隆文库，用与重叠群末端相对应的寡