分子生物学课堂作业

一、简述microRNA加工成熟的主要步骤1.由RNApolⅡ启动子启动转录，得一具有帽子结构和多聚胺苷酸尾巴的pri-miRNA为初产物。2.Pri-miRNA在核内经RNaseⅡenzymeDrosha,DGCR8及一个双链RNA结合蛋白组成的“微处理器”复合物处理。Drosha从pri-miRNA发夹结构末端切下八个核苷酸得到3’端有两个碱基位点，5’端为磷酸盐基团的茎环结构的产物，即pre-RNA。3.miRNA由基因组中某个基因座位转录生成具有5’端帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA。之后在Drosha/DGCR8作用下加工成为pre-miRNA，再经Exportin-5转运至细胞质pre-miRNA经过Dicer的进一步剪切形成成熟miRNA，miRNA再与RISC以不完全互补的方式结合。二、设计siRNA控制特定基因表达时，序列选择上有哪些注意事项？RNAi最后要通过siRNA片段和靶基因结合并使之降解。1siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好。2siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(Nn)UU(N代表任意碱基。3siRNA3′端突出碱基的选择当siRNA的3′端突出碱基为UU时，其基因抑制效率最高；但是3′端的突出碱基不能为G，因为RNase会降解以G为末尾的RNA单链。4siRNA序列中G/C含量的选择在siRNA序列中，G/C含量的选择比确定以AA为起始的序列更重要。5siRNA中应避免连续的单一碱基和反向重复序列因为连续2个以上的G和C可以降低双链RNA的内在稳定性，从而抑制RNAi作用；连续3个以上的U和A可能终止由RNAPolymeraseIII介导的转录[13]。siRNA序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构，这种结构的存在可以降低siRNA的有效浓度和沉默效率。6siRNA双链的内在稳定性siRNA反义链5’端具有较低的热稳定性，即反义链5’端的第一个碱基为A或U；siRNA正义链的5’端第一个碱基为G或C。7siRNA正义链的碱基偏爱性以3’端具有2个碱基突出的19ntsiRNA为例，正义链的第一位和第十九位碱基为A；正义链的第十位碱基为U；正义链的第十三位碱基不为G；正义链的第十九位碱基不为G或C时，siRNA序列具有较高的基因沉默效率。8设计的siRNA序列数目目前没有发现siRNA的干扰效率与mRNA中具体位置的关系，为确保对靶mRNA的有效抑制，针对每一个靶基因应该设计4条以上siRNA序列，进行化学合成后，通过实验筛选出沉默效率最高的siRNA序列进行下一步的基因功能研究。三、CRISPR有哪些临床应用潜力？1.CRISPR基因，抑制CRISPR系统V可以使细菌在免疫系统V面前显形，并加速疫苗的研发。2.利用CRISPR技术进行人多能干细胞基因组编辑，重新编程细胞再生器官和组织。3.用CRISPR编辑HPV基因杀死宫颈癌细胞来自杜克大学的研究人员发表在《JournalofVirology》的一项研究利用基因组编辑工具CRISPR，选择性地破坏两个负责宫颈癌细胞生长和存在的乳头瘤病毒（HPV）基因（E6和E7），从而使癌细胞自我毁灭。杜克大学医学院分子遗传学教授BryanR.Cullen称：“只要关闭E6或E7，宿主防御机制就会再次恢复，癌细胞会立即自杀。”4.用CRISPR构建癌症模型来自麻省理工学院的研究人员发表在《Nature》上的一项研究称，CRISPR基因编辑系统可将致癌突变导入到成年小鼠的肝脏中，使科学家们能够更快速地筛查这些突变。为了探究CRISPR在构建小鼠癌症模型中的潜在用途，研究人员首先利用它敲除了p53和pten。利用Cas酶靶向切割p53和pten基因片段，研究人员在大约3%的肝细胞中破坏了这两个基因，使得在3个月内生成了肝肿瘤。此外，研究人员还利用CRISPR构建出了携带β-catenin癌基因的小鼠模型，这一基因可使得细胞在随后发生其他的突变时更有可能癌变，他们在0.5%肝细胞中取得了成功。5.CRISPR改写β-地中海贫血突变基因β-地中海贫血是由HBB基因突变引起的，会造成严重的血红蛋白缺乏。据估计，全世界每十万人中有一人受到这种疾病的影响，目前还没有能够治愈β-地中海贫血的办法。8月5日发表在《GenomeResearch》杂志上的一项研究中，来自加州大学旧金山分校的简悦威教授及其同事尝试用CRISPR改写这种疾病的突变基因。6.CRISPR技术根除HIV病毒艾滋病病毒与其它逆转录病毒一样，其遗传物质也是整合到人体宿主基因组上进行复制，虽然抗逆转录病毒疗法可以有效的抑制艾滋病毒，但是却不能根除这些整合性病毒。然而，7月21日发表在《美国国家科学院院刊》上的一篇文章中，研究人员利用基因组编辑技术CRISPR的精确剪切，将艾滋病毒从人类基因组中完全剔除。7.CRISPR重现肿瘤染色体易位《NatureCommunications》杂志上，来自西班牙国立癌症研究中心(CNIO)和西班牙国家心血管研究中心(CNIC)的科学家们，通过CRISPR技术第一次成功地在来自血液和间质组织的人类干细胞中重现了与两种癌症类型（急性髓性白血病和尤文氏肉瘤）相关的染色体易位。8.CRISPR技术治愈肝病小鼠发表在《NatureBiotechnology》杂志上的一项研究中，来自麻省理工学院的研究人员利用CRISPR技术治愈了因单一遗传突变致罹患一种罕见肝病的小鼠，该研究首次为CRISPR技术可以逆转活体动物的疾病症状提供了证据。四、DNA甲基化与组蛋白修饰在调控基因表达上有哪些异同？组蛋白修饰包括多种形式，如乙酰化，甲基化，凡素化磷酸化等，组蛋白修饰主要通过对染色质组蛋白尾巴进行化学修饰，改变染色质空间结构，调节影响临近基因活性。然后组蛋白修饰通常是组蛋白乙酰化水平增加导致基因表达增加而组蛋白甲基化导致基因降低，但也有例外。而dna甲基化则是，dna高水平甲基化沉默基因表达，DNA甲基化水平降低则表明基因表达增加。然后组蛋白是核小体层面，DNA是cpg岛层面。五、长非编码RNA（lncRNA）与mRNA有哪些区别？1.定义长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)：是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。[1]研究表明,lncRNA在剂量补偿效应(Dosagecompensationeffect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用。信使RNA：是由DNA的一条链作为模板[1]转录而来的、携带遗传信息的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。2.分类长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)：反义长非编码RNA、内含子非编码RNA、lincRNA、启动子相关lncRNA、非翻译区lncRNA信使RNA：真核mRNA和原核mRNA3.结构：长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)：长度在200-100000nt之间的RNA分子、不编码蛋白、lncRNA参与细胞内多种过程调控信使RNA：生物体内的每种多肽链都由特定的mRNA编码，所以细胞内mRNA的种类很多，但通常每种mRNA的拷贝数极少（1～10个）。根据信息密码学说，3个连续的核苷酸可以编码一个氨基酸，因此从已知mRNA（或DNA）核苷酸顺序可以准确推导出蛋白质的一级结构。4功能长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)：长链非编码RNA的表达不仅具有细胞型和组织特异性,一些长链非编码RNA还仅在真核生物发育过程的特定阶段表达[1]。对线虫和果蝇发育过程中长链非编码RNA的表达研究发现,这类RNA分子呈现出动态的表达变化,多数长链非编码RNA具有精确的时间和空间表达模式,有的表达模式还保守地存在不同种的果蝇中[5]。原位杂交分析中发现,在黑腹果蝇的胚胎发育过程中高表达的33个mRNA-like长链非编码RNA,有16个仅在中枢或者外周神经系统中得到表达。研究发现,长链非编码RNA的表达或功能异常与人类疾病的发生密切相关,其中就包括癌症、退行性神经疾病在内的多种严重危害人类健康的重大疾病,具体表现为长链非编码RNA在序列和空间结构上的异常、表达水平的异常、与结合蛋白相互作用的异常等信使RNA：生物体内的每种多肽链都由特定的mRNA编码，所以细胞内mRNA的种类很多，但通常每种mRNA的拷贝数极少（1～10个）。根据信息密码学说，3个连续的核苷酸可以编码一个氨基酸，因此从已知mRNA（或DNA）核苷酸顺序可以准确推导出蛋白质的一级结构。5特征长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)：lncRNAs通常较长，具有mRNA样结构，经过剪接，具有polyA尾巴与启动子结构，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式。lncRNAs启动子同样可以结合转录因子，如Oct3/4，Nanog,CREB,Sp1,c-myc,Sox2与p53，局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰方式与结构特征。大多数的lncRNAs在组织分化发育过程中，都具有明显的时空表达特异性，如有人针对小鼠的1300个lncRNAs进行研究，发现在脑组织中的不同部位，lncRNAs具有不同的表达模式。在肿瘤与其他疾病中有特征性的表达方式。序列上保守性较低，只有约12%的lncRNA可在人类之外的其它生物中找到