四环素的发酵参数及生产工艺研究

（2016年1月科研训练论文(文献综述)题目：四环素的发酵参数及生产工艺研究学生姓名：学号：学院：化工学院班级：班四环素的发酵参数及工艺研究姓名：指导教师：内蒙古工业大学化工学院，呼和浩特，010051摘要：四环素(Tetracycline),是一种对抗立克次体、多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌等病原体的“广谱”抗生素，另外，四环素也是一种重要的饲料添加剤，拥有广阔的市场前。四环素的工业生产通常采用发酵法，该方法以金色链霉菌为发酵菌株，从而生产合成四环素。随着工业的快速发展传统方法合成四环素已经不足以满足工业化生产，而本文通过控制发酵中的发酵参数，从而让其发酵过程朝着产率高的方向进行。同时也提供了向培养基中加溴化钠水溶液和四环素通氨补料方法的发酵工艺。关键词：四环素；金色链霉菌；发酵参数；发酵工艺引言在发酵工艺过程中搅拌速度、通气量、发酵液的粘度、温度、发酵液pH、发酵罐的压力、搅拌速度等因素，都会不同程度的影响四环素的产率，因此在生产工艺过程中对发酵参数的控制，将会朝着产率高的方向进行。不同的发酵工艺方法也会有不同的产率，好的发酵方法不仅生产工艺途径短，还能经济实惠。一、发酵参数利用发酵法生产合成四环素主要控制参数一般分为物理参数、化学参数、生物参数三类。（一）物理参数1、温度：微生物发酵所用的菌体绝大多数是中温菌，如霉菌、放线菌和一般细菌。它们的最适生长温度一般在20～40℃。在发酵过程中，需要维持适当的温度，才能使菌体生长和代谢产物的合成顺利进行.如四环素生产菌在30℃时合成金霉素，35℃时，只产生四环素，合成方向会改变,利用自动控制或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹层或蛇行管中，通过热交换来降温，保持恒温发酵[1]。2、压力：发酵罐压一般为0.02-0.05Mpa[2]3、搅拌转速:随着发酵过程的进行，发酵液中菌株浓度不断増大，发酵液粘度也随之不断上升，从而导致传质系数KLa下降，进而导致溶氧量下降，而溶氧量的过度降低会对菌株的生长代谢产生不利影响。为避免上述情況，向发酵培养基中添加溴化钠水溶液，配合一定的搅拌速度，能够减少由于菌株浓度增大产生的泡沫和滞留液膜，降低发酵培养基的粘度，从而提高其流变特性、KLa和溶氧水平，进而有利于菌株的发酵。搅拌转速200-900r/Min为宜[3]。4、通气量：加大通气流量不仅会増加发酵液的蒸发损失，还会带走一些挥发性的代谢中产物，从而导致能耗增加、产率降低。适宜的通气量尤为重要，本发明的工艺参数通气比为1:0.52[5]。5、浊度：反映单细胞生长状况的参数。如大肠杆菌，用光密度650nm上检测或计数板计数。6、料液流量（L/min）:这是控制流体进料的参数。（二）化学参数1、PH：四环素为两性化合物，等电点为PH5.4,此时以游离形式存在，PH4-7.2范围内难溶于水，低于pH4的酸或高于PH8的碱性溶液中，溶解度很高。首先考虑和试验发酵培养基的基础配方，使它们有个适当的配比，使发酵过程中的pH值变化在合适的范围内,而四环素合成适宜PH为5.8-6.0[2]。2、溶解氧浓度随着发酵过程的进行，发酵液中菌株浓度不断増大，导致溶氧量下降，而溶氧量的过度降低会对菌株的生长代谢产生不利影响，而向发酵液加入溴化钠水溶液，提高培养基的流变特性和溶氧水平[10]。3、溶解CO2浓度四环素生物合成的适宜CO2浓度为2%-8%，浓度超过15%将抑制菌体生长[2]。（三）生物参数1、菌丝形态：观察菌丝形态是生产中最常用的方法。每隔8小时镜检，能及时发现异常染菌。四环素生产，生产菌生长分为I.孢子发芽，II.次生菌丝增殖，III.产物分泌，出现空胞，IV.菌丝自溶，菌丝形态模糊[4]。2、菌体浓度：对初级产品来说，菌浓愈大，产量愈高，但菌浓符合生长曲线。次级产品如菌浓过大，由于代谢产物的积累，会影响产量。因其产品与原料并非对应（或底物抑制，分介产物抑制等）[7]。二、四环素的发酵工艺研究四环素的工业生产通常采用发酵法，该方法以金色链霉菌为发酵菌株。发酵过程中，发酵液的溶氧量对金色链霉菌菌株的生长代谢有很大的影响。而该溶氧量与发酵液的传质系数(KLa)成正比[9]。影响KLa的主要因素包括搅拌速度、通气量、发酵液的粘度、发酵液的表面张力、发酵液的离子强度等。随着发酵过程的进行，发酵液中菌株浓度不断増大，发酵液粘度也随之不断上升，从而导致KLa下降，进而导致溶氧量下降，而溶氧量的过度降低会对菌株的生长代谢产生不利影响[5]。目前大多采用以下方法提高发酵液的KLa；1)加大搅拌速度；2)加大通气流量；3)添加水分。上述方法虽然在一定程度上缓解了KLa的下降趋势，然而这些方法存在诸多不尽如人意的地方，例如加大搅拌速度会对菌株造成不同程度的损伤，这是因为金色链霉菌对剪切力十分敏感；而加大通气流量不仅会増加发酵液的蒸发损失，还会带走一些挥发性的代谢中产物，从而导致能耗增加、产率降低；添加水分虽然能降低发酵液的粘度，但会导致发酵液的滲透压迅速降低，从而干扰菌株正常的生长代谢。（一）向发酵培养基加入溴化钠水溶液法在发酵过程中，向发酵培养基中添加溴化钠水溶液。采用这一方法，通过向发酵培养基中添加溴化钠水溶液，一方面，能够减少由于菌株浓度增大产生的泡沫和滞留液膜，降低发酵培养基的粘度，从而提高其流变特性、KLa和溶氧水平，进而有利于菌株的发酵；另一方面，添加溴化钠水溶液，还能增加发酵培养基中的电解质浓度，进ー步降低泡沫的产生，同时能够使发酵培养基维持适宜菌株生长的滲透压。1、生产菌种本课题采用四环素生产菌，即金色链霉菌，通过在培养基加入抑氯剂和氯的竞争剂时，能合成高产量的四环素。其在固体培养基上分泌金黄色色素，气生菌丝无色素。孢子在气生菌丝上排列成链状、圆形或椭圆形。初期是白色，后期变灰黑色，发酵中用亚甲蓝染色，看菌丝状态[6]。变化特征为第一期：原生菌丝期，孢子发酵，成菌丝团第二期：次生菌丝期，菌丝团散开，生成大量次生菌丝第三期：产物分泌期，菌丝变短，出现空胞第四期：菌丝自溶期，菌丝模糊，自溶降解[2]。2、斜面培养取金色链霉菌（Aareys)菌株在无菌条件下接种于预先制备好的固体斜面培养基上，在35°C下恒温培养5天[15]。上述固体斜面培养基是按照常规方法制备的，其配方为3.2G/L麸皮，2.5G/L琼月旨，0.16G/L磷酸铵，0.1G/L磷酸氢ニ钾，0.05G/L硫酸镁[3]。3、种子制备种子培养将斜面培养后的菌株在无菌条件下接种到预先制备好的种子培养基中，在33°C、300R/Min的条件下培养22-25H，得到种子液[14]。上述种子培养基是按照常规方法制备的，其配方为3.4G/L葡萄糖，2.9G/L黄豆饼粉，0.6G/L玉米浆，0.5G/L硫酸铵，0.01G/L磷酸ニ氢钾，0.02G/L硫酸镁，0.15G/L溴化钠，0.4G/L碳酸钙，0.6G/L酵母粉[13]。4、发酵培养发酵培养将种子制备步骤所得种液在无菌条件下接种到预先制备好的发酵培养基中，在30°C，搅拌转速200r/Min的条件下进行发酵，发酵过程的通气比为1:0.52[12]。发酵开始后60h，向发酵培养基中添加溴化钠水溶液。所述溴化钠水溶液,其体积为发酵培养基体积的2%，其中溴化钠的浓度为0.005g/L和加入微量硫氢化苄（0.0001%-0.0002%）。发酵开始后180h，停止发酵，測定所得发酵液中四环素的效价，结果为30000U/mL。上述发酵培养基是按照常规方法制备的，其配方为8G/L淀粉，2.5G/L黄豆饼粉，2g/L玉米浆，5G/L硫酸铵，0.015G/L磷酸ニ氢钾，0.008G/L硫酸锰，0.15G/L溴化钠，0.002G/LM-促进剂，0.6G/L碳酸钙，0.008G/L淀粉酶[3]。得出的结论是比传统工艺生产的效价高。5、此方法的发展前景简便易行的方式增大发酵培养基的KLa值，效果良好。试验表明，采用所述方法，四环素的产率提高16%以上[3]。通过与传统方法相比，过程与方法相差无几，但是大大提高了四环素的产率，发展前景广阔。（二）四环素通氨补料法四环素通氨补料是四环素发酵工艺的一种新方法。四环素发酵原工艺的缺点是点是发酵单位低。通氨补料是用通氨的方法创造菌种生长适应的pH值,强化菌种代谢，补充营养,以达到提高发酵单位的的。东北制药总厂、沈阳市第二制药厂都采用了通氨补料工艺,取得了显著效果。四环素产品的发酵单位、收率、全耗、主耗等各项技术经济指标,都刷新了历史最好水平。东北制药总厂在学习华北药厂先进经验的基础上,结合该厂在原料、设备、空气动力等方面的实际条件，选择了通氨补料菌种、培养基配方和工艺控制条件,经半年多的生产试验证明,它有如下几个优点:1、平均发酵单位由18208)/ml提高到215497/ml;2、总收率提高18.6%;3、罐批产量提高94公斤;4、主要原材料总耗下降6.6公斤/十亿;5、年节约化工原料250吨,年节约价值26万元[8]。结论通过对本课题的研究探讨以及对相关文件的查找与整理，在发酵法合成四环素的工艺过程中，向发酵培养液加入溴化钠水溶液，一方面，能够减少由于菌株浓度增大产生的泡沫和滞留液膜，降低发酵培养基的粘度，从而提高其流变特性、KLa和溶氧水平，进而有利于菌株的发酵；另一方面，添加溴化钠水溶液，还能增加发酵培养基中的电解质浓度，进ー步降低泡沫的产生，同时能够使发酵培养基维持适宜菌株生长的滲透压。而培养基一和传统工艺四环素效价对比中，能得出，此方法能够增大发酵培养基的KLa值，效果明显提高了四环素的产率。四环素通氨补料法，从上所述，经济方面经济实惠，原材料的利用率得到提高。效益方面，产率提高，效率提升。参考文献[1]邢杰,汤长林.锥形发酵罐(C.C.T)发酵温度控制与发酵质量的几点认识.生物科技.2005，12：2-5.[2]元英进.制药工艺学.北京.化学工业出版社.2007[3]张宝荣,吴飞,魏伟.一种发酵生产四环素的方法.生物技术.2012,14,33-34[4]王清海.链霉菌R15作用机制及β-葡萄糖苷酶的纯化与特性研究.山东大学.2006[5]B.V.R.Bornot.al.HandbookimentalPharmaeology,1955,vol.78,137-178[6]蒋增良.天然微生物酵素发酵机理、代谢过程及生物活性研究.应用化学，2013,42-43.[7]左勇.金霉素摇瓶发酵控制条件的优化.四川理工学院学报(自然科学版).2012.[8]周毅，李栋.四环素通氨补料工艺.济南大学.2008.[9]Zhi-FaLv.Meta-analysis:IscombinationoftetracyclineandamoxicillinsuitableforHelicobacterpyloriinfection.WorldJournalofGastroenterology.2015.[10]BingLi.Characterizationoftetracyclineresistantbacteriainsalineactivatedsludgeusingnext-generationsequencinganalysis.ProceedingsoftheInternationalWorkshopontheEnvironmentalDimensionofAntibioticResistance.2013.[11]谭峰.四环素和喹诺酮类药物分析方法研究.西北大学.2001.[12]孟春.金色链霉菌碳代谢流量变化特性的研究.高校化学工程学报.2004.，11.[13]洪文荣.妥布霉素产生菌黑暗链霉菌F-211发酵特性研究.福州大学学报(自然科学版).1998,3.[14]骆健美.纳他霉素高产菌株选育、发酵条件优化、发酵动力学及溶解度的研究.浙江大学.2005.[15]花玉鹏.链霉菌AO2发酵工艺研究.河南农业大学.2011.[16]王凤.白色链霉菌高密度发酵产ε-聚赖氨酸的研究.华南理工大学.2013.