分子生物学实验的常见问题与解决方案

东华理工大学分子微生物实验室核工楼413郭勤总结参考胡老师博客分子生物学实验的常见问题与解决方案-1一、Southern杂交问题1：电泳后发现凝胶中DNA扩散，导致结果难以确定，如何解决这一问题？解决方案：（1）在操作上：电泳时隔孔上样，电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好，尤其是不应含有内切酶，否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。问题2：传统方法中转膜不完全的问题如何克服？解决方案：经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。利用地高辛标记探针进行Southern杂交时，对于大于15kb的DNA片断，转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率,但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的DNA被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。如果实验转膜过程中同时含有大于15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物)，那么在转移的过程中倾斜容器，仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸，这样既可以提高大片断DNA的转移效率，又不会打碎小片段DNA。另外，等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法，来解决这一难题：以转基因鼠的检测为例，实验步骤如下：1.转基因鼠的建立：以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF基因为构件，建立转基因小鼠。转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液，取少量电泳检查酶切完全后，上样电泳8小时，(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时，用镊子轻轻揭起凝胶，放于变性液(0.5MNaOH，0.5MNaCl)20分钟，转置中和液(0.5MTrisHCl，0.15MNaCl)20分钟，将胶放于玻璃板上沥干液体，室温放置30分钟。(3)干胶应立即杂交。先将胶在水中泡一下，以利于操作。(4)将胶放人杂交液(6×SSC、5×Denhardt’S、0.25%SDS、100μg/ml鲑鱼精DNA)，加人探针，42℃杂交16-20东华理工大学分子微生物实验室核工楼413郭勤总结参考胡老师博客小时。(5)杂交完成后，洗膜8轮，42℃每次15分钟。2×SSC、0.1%SDS、1×SSC、0.1SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、各洗两次，在冰水中浸泡2分钟，以利于盐的排出。(6)干燥后按检测试剂盒操作，室温压片0.5-2小时。冲片照相。使用的探针为G-CSF。DNA，探针标记采用Fluorescein-12-dUTP，检测试剂盒为杜邦公司产品，操作按试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶直接杂交的方法，较好地解决了微量核酸或低拷贝数转基因的检测问题，结果不仅直观，而且特异性好。与常规的Southern杂交相比，它所具有的优势是，它省略了将DNA进行转膜的步骤，从而避免了因转膜不完全所造成的DNA量的损失，特别是低拷贝数基因的丢失。另一方面，也使复杂的Southern杂交操作程序大大简化。因此，在转基因鼠的鉴定中以及微量核酸检测、疾病诊断中是防止低拷贝数基因漏检的一种可行途径。问题3：在向下转膜法中，如何提高转膜效率？解决方案：1、转移液的水平面应略低于凝胶的水平面。如果转移液的水平面高于凝胶，短时间内会有大量液体聚集在凝胶上，直接从侧面流失；果转移液的水平面过分低于凝胶，影响纱布的吸水力，转移效率下降。2、吸水纸吸水后易变形，使吸水纸与滤纸间产生空隙，而降低吸水纸的吸水效率，应及时更换吸水纸。3、过夜转移时，及时添加转移液，防吸干。4、样本丰度高时，移时间可以缩短至1小时，此时凝胶上仍可见大分子量DNA的残留，当样本丰度低时，以延长转移时间。5、纱布上不要加盖重物，防凝胶受压变薄，响转移效率。问题4碱转移结束后的尼龙膜潮湿不利于保存，且防止长期保存过程中DNA结合不紧密影响杂交效果，应如何做？解决方案：将尼龙膜置于滤纸上干燥片刻，在紫外交联仪中将转有DNA的一面向上12000J交联4min，若尼龙膜暂不杂交，可在4℃下保存备用但存放时间不宜超过半年。问题5使用碱转移法，将导致杂交后探针的去除困难，几乎80%-90%的探针难以洗脱，如何解决这一问题？东华理工大学分子微生物实验室核工楼413郭勤总结参考胡老师博客解决方案：将煮沸的5g/LSDS溶液倒在膜上,待溶液自然冷却至室温,可除去膜上已杂交的DNA探针。洗脱后的尼龙膜,可反复用于其他探针的杂交(至少可耐5轮杂交与洗脱)。问题6：Southern杂交中，探针的背景高，应如何解决？解决方案：用随机引物法标记的探针要想得到最低的背景，在向尼龙膜上加prob-DIGEasyHyb混合物前,要用0.45μm醋酸纤维素膜过滤，勿用硝酸纤维素滤膜过滤。对每一个探针和目的片段，总是要根据经验确定最合适的杂交条件，探针浓度很关键，如果太高，将会非特异性结合到膜上；太低，敏感性会降低。利用地高辛标记探针进行Southern杂交时，以下2种措施可降低背景：(1)适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度；(2)控制地高辛抗体的浓度。使用足够量的地高辛抗体可以获得较好的杂交信号,但过量的地高辛抗体会在膜上产生非特异结合斑点。问题7：Southern杂交没有检测出出杂交信号的原因，如何解决？解决方案：（1）目的DNA在总DNA中所占的比例，一般需要10μgDNA样品,如果样品中目的基因含量较高,可以按比例减少DNA用量。如果基因组中目的基因的拷贝数较低,致使常规的基因组用量不能满足Southern杂交的需要,此时可加大基因组的用量；（2）探针的浓度和比活性：在杂交袋中杂交需要0.2ml/cm2的杂交液；使用圆筒状瓶子进行杂交可以使用较小的体积，约0.1ml/cm2。（3）转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对：（见问题2，3）二、蓝白斑筛选问题1：做蓝白斑筛选只见白斑，不见蓝斑，该如何做？解决方案：（1）做空白对照，将没有进行重组的宿主菌直接接入含有IPTG和X-galLB琼脂糖平板在37℃下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4℃两小时，蓝色会加深。如果正常显色，说明试剂，培养基及菌没有问题，如果不能正常显色，更换试剂重新配置培养基或者接入新的菌种，再次培养，确保空白东华理工大学分子微生物实验室核工楼413郭勤总结参考胡老师博客对照结果正确。（2）若空白试验结果正确，用牙签挑取白色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，确定是否重组，即PCR扩增后的反应液中加入2μl的6×上样缓冲液，混匀，上样至已预电泳的10％非变性PAGE加样孔中，200V电压电泳后，取胶至EB液中染色30min，最后在紫外灯下数码照相。比对结果，判断白斑是否为重组子。问题2：做蓝白斑筛选时，只见蓝斑，不见白斑该如何做？解决方案：（1）做空白对照，将没有进行重组的宿主菌直接接入含有IPTG和X-galLB琼脂糖平板在37℃下培养17小时以上以便显色。显色后将平板置于4℃两小时，蓝色会加深。观察对照的蓝色是否和实验组的颜色一样，如果实验组的蓝色较浅，可能载体带有插入片段，但没有阻断lacZ阅读框。（2）用牙签挑取浅蓝色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，确定是否重组，即PCR扩增后的反应液中加入2μl的6×上样缓冲液，混匀，上样至已预电泳的10％非变性PAGE加样孔中，200V电压电泳后，取胶至EB液中染色30min，最后在紫外灯下数码照相。比对结果，判断浅蓝色菌落是否为重组子。三、外源基因在大肠杆菌的表达问题1：外源基因在大肠杆菌中高效表达易形成包含体，包含体形成有利于表达产物的纯化，但降低产生大量不具有生物活性的产物，如何降低包涵体的形成？解决方案：（1）采用胰胨-磷酸盐培养基能够限制包含体的形成。（2）培养液中加入甜菜碱和山梨醇来改变渗透压，使表达产物由包含体形式转变为活性状态，将温度从37℃降低到25℃时诱导表达，可降低包含体的形成。（3）选用pMBI衍生而来的载体质粒，因为其可以协同表达DnaK-DnaJ或GroEL-GroES，增加凝结蛋白的溶解度。分子伴侣折叠作用效率与细胞DnaK-DnaJ和GroEL-GroES的浓度有关，与表达蛋白的性质有关。东华理工大学分子微生物实验室核工楼413郭勤总结参考胡老师博客问题2：在lac、tac表达系统中IPTG用于诱导lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG，应如何做？解决方案：（1）lac和tac启动子的转录受温度严紧调控：把阻遏蛋白LacI的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或整合到染色体后，均能使lac和tac启动子的转录受到温度严紧调控在较低温度（30℃）时抑制，在较高温度（42℃）时开放。（2）用乳糖替代IPTG诱导lac和tac启动子的转录：乳糖在Β-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代lPTG作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。问题3：T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。解决方案：在表达系统中低水平表达T7溶菌酶基因：因为T7溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与T7RNA聚合酶结合抑制其转录的活性。目前T7溶菌酶基因都通过共转化质拉导入表达系统，它能明显降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。问题4：为了提高外源基因的表达水平，对表达载体如何进行改进？解决方案：(l)可诱导拷贝数的表达载体。质粒的拷贝数由培养条件控制，当需要增菌培养时，质粒的拷贝数很低，每个细胞仅1-5个拷贝，经适当条件诱导后，载体拷贝数可达每个细胞100-500个拷贝。这种表达载体的优点减小了载体质粒的丢失，保证质粒在大肠杆菌中的稳定性，对外源基因的表达调控更为严格，有利于基因的高效表达。这里主要有两类条件控制拷贝数的表达载体，一类是基于质粒Rl基础上的单复制起始表达载体；另一类是双复制起始表达载体，一个复制起始来源于Co1EI，另一个来源于质粒pSC101。(2)多顺反子型表达载体。这种表达载体的设计在于将第二个顺反子的SD序列插入在第一个顺反子的终止密码子TAA之前，第一个顺反子要尽量短，后面接目的基因的起始密码子ATG。由于第一个顺反子翻译地有效起始，使得大量的核糖体结合在多