公园小区草坪草地公园防水喇叭功放参数

OneBioMultimediaCourses微生物知识概况及污染菌库的建立主要内容微生物知识概况•什么是微生物？•微生物学与人类的关系•微生物的特点污染菌库的建立•收集→分离纯化→保藏→鉴定→数据处理与应用2/92内容一：微生物知识概况一、什么是微生物？•微生物的定义•微生物的种类•微生物的形态•微生物的特点二、微生物学与人类的关系3/9214一、什么是微生物？1、微生物的定义一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。它们都是一些体积微小，结构简单的低等生物。微生物个体微小结构简单进化地位低等微米级、纳米级单细胞、简单的多细胞、非细胞原核类、低等真核类、非细胞类4/922、微生物的种类按其结构、化学组成及分化程度可分为:★原核类:仅有原始核质，无核仁或核膜，细胞器很不完善。★真核类:细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体，细胞器完整。★非细胞类:体积微小，能通过除菌过滤器。5/922、微生物的种类微生物原核生物真核生物非细胞微生物细菌、放线菌、蓝细菌酵母、霉菌、蕈菌病毒亚病毒（类病毒、拟病毒、阮病毒）支原体、衣原体、立克次氏体6/923、微生物的形态3.1微生物的菌落形态7/9214四大类微生物菌落比较表类别细菌放线菌酵母菌霉菌培养基牛肉膏高氏一号马铃薯马铃薯菌落形状小点状，多为圆形，个别呈根状，辐射状圆形辐射状多为原形疏松的绒毛状、絮状、蜘蛛网状，有的无固定大小大小一般较小较小比细菌大而厚大颜色多样（乳白、灰白、灰、红、荧光等）正反面颜色相同多样（灰白、白、红、粉红、蓝、紫、橙等）正反面颜色不同多为乳白色多样（白，灰蓝、绿黑、粉红等）正反面一般颜色不同表面状态光滑或粗糙，湿润或干燥，较粘初期似细菌菌落，晚期为粉状干燥表面湿润粘稠绒毛状，粉状，棉絮状，蜘蛛网状，菌丝疏松生长速度一般较快慢较快快与基质结合程度不牢牢固，不易挑取不牢较牢生长范围有限有限有限多为无限气味往往有臭味有泥腥味常有酒香味往往有霉味8/92把细胞个体形态与菌落特征一块比较：四大类微生物的比较99/923.2微生物的显微形态类别形态举例细菌球菌直径为0.8-1.2μm，呈球形、类球形。双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。杆菌一般长2-5μm，宽0.5-1.0μm。各种杆菌的长短宽窄不一。炭疽杆菌、结核杆菌、大肠杆菌等。螺形菌菌体呈弯曲状，弧菌有数个弯曲，呈香蕉状，螺菌有数个弯曲。弧菌和螺菌。真菌酵母菌大小比细菌大得多，为葡萄球菌的数倍至几十倍，小的肉眼看不见，大的如木耳、蘑菇、灵芝。酿酒酵母菌、路德类酵母菌等。霉菌青霉菌、曲霉菌等。常见微生物显微结构比较表10/92葡萄球菌酵母菌(芽痕)棒状杆菌大肠杆菌弧状菌链球菌11/92青霉菌犁头霉12/92沙门菌铜绿假单孢菌生孢梭菌枯草芽孢杆菌13/924、微生物的特点个体小,面积大：小于0.1mm。肉眼不可见。分布广,种类多（10万多种）：自然界中到处都有，如水、空气、土壤等,土壤中的数量最多。代谢强，转化快：发酵乳糖的细菌在1小时内可分解其自重1000～10000倍的乳糖；产朊假丝酵母合成蛋白质的能力比食用公牛强10万倍。生长旺，繁殖快：微生物有惊人的繁殖速度，大多数微生物几十分钟内就可以繁殖一代。适应性强，易变异（耐药性产生的原因）14/92二、微生物与人类的关系微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋”中。15/92二、微生物与人类的关系•微生物在哪里?16/9217/92•细菌数亿/g土壤，土壤中的细菌总重量估计为：10034×1012吨；•每张纸币带细菌：900万•人体体表及体内存在大量的微生物：皮肤表面：平均10万个细菌/平方厘米；口腔：细菌种类超过500种；肠道：微生物总量达100万亿，粪便干重的1/3是细菌，每克粪便的细菌总数为：1000亿个；•每个喷嚏的飞沫含4500-150000个细菌，重感冒患者为8500万。18/92时时刻刻与微生物“共舞”是祸？是福？微生物既是人类的敌人，也是人类的朋友！1919/92微生物是自然界物质循环的关键环节；微生物是人类的朋友！体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证；帮助消化、提供必需的营养物质、组成生理屏障微生物可以为我们提供很多有用的物质；醋、酶、各种药物、疫苗、面包、奶酪、啤酒、酱油等基因工程为代表的现代生物技术；2020/92微生物是人类的敌人！鼠疫天花艾滋病狂犬病埃博拉病毒……天花病毒康熙爱德华·詹纳2121/92二、微生物与人类的关系•可以说，微生物与人类关系的重要性，怎么强调都不过分.•微生物是一把十分锋利的双刃剑，它们在给人类带来巨大利益的同时也带来“残忍”的破坏。•它给人类带来的利益不仅是享受，而且实际上涉及到人类的生存。22/92内容二：污染菌库的建立污染菌库建立的目的和应用污染菌库建立的步骤23/92一、污染菌库建立的目的和应用目的：应新版GMP要求，需对环境、原辅料及不同阶段产品监控或检测到的微生物进行鉴定，并建立污染菌种库。便于对日常监测中出现异常菌株与菌种库进行比对，查找其来源，并针对菌种特性对相应的监控环境采取有效措施进行消毒。124/92目的：•长期有规律地对环境、检品中的微生物进行监控，了解环境中的微生物污染种类和变化趋势，并作为质量控制文件加以保存，对企业日常生产质量管理和监管机构的监督检查都是有益的补充。225/92应用：对实验室洁净环境、各种检品进行监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力1建立实验室环境微生物信息库、动态监控环境微生物的变化、建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。26/92应用：2增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据在严格依据法定方法进行检验的同时，结合微生物鉴定技术平台，对检验过程和检验结果进行双重复核和监控。通过对比监测的微生物种群类别和样品微生物种群情况，客观准确的评价检验质量，增加检验报告的含金量。27/92应用：3与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系美国FDA要求药厂将微生物鉴定到“种”一级，并建议在微生物形态和生化反应鉴定之外采用基因分型技术进行分析，以便对生产环境的微生物污染进行监控。28/92二、污染菌库建立步骤污染菌的收集3.2.1.污染菌库数据的处理与应用污染菌的分离纯化4.菌种的保藏菌种的鉴定5.29/92一、污染菌的收集污染菌收集分类污染菌采集地点环境监控污染菌收集化验室生产---有毒区生产---无毒区分包装车间原辅料、不同阶段样品监控污染菌收集成品组原辅料组生产---有毒区生产---无毒区30/92一、污染菌的收集31/92二、污染菌的分离纯化•定义：样品或环境监控到的微生物有的呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离，即将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。•目的：使样品或环境中监控到的微生物长成单菌落后，便于后续的鉴定和保藏工作。32/92•方法：稀释涂板法、稀释混合平板法、划线分离平板划线分离法33/92各浓度做三个平皿挑选单菌落接种斜面稀释涂板法从土壤分离微生物操作过程34/92三、污染菌的保藏一、菌种保藏（一）保藏目的及原理（二）菌种保藏的方法（三）菌种保藏注意事项二35/92（一）菌种保藏目的及原理目的原理创造不利于菌种生长的一切条件，使其代谢处于休眠状态。不生长不死亡不污染不降低或不丧失其优良性以尽量延长使用时间3636/92低温干燥无氧缺营养不利条件3737/92（二）菌种保藏的方法生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥3838/92常用保藏法简介特点简便保藏时间短易污染及退化1.斜面低温法斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月）39/9240/922.矿油保藏法无菌检验？注入种管淹没斜面约1cm矿油处理灭菌：152kpa、30min去水：40~50℃烘至无色透明口堵胶塞用时转管再转管方法简便的优点适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存。某些细菌不宜采用此法进行保存。特点41/9242/923.超低温冷冻保藏•要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60～-80℃以下进行保藏。•在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。43/92•如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。•若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。44/924.磁珠保藏法45/925.液氮冷冻保藏法•液氮超低温保藏法是近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法。•原理:用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达－196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（－130℃），所以此时菌种的代谢活动已基本停止，化学作用亦随之消失。46/92常用保藏方法比较47/92（三）菌种保藏的注意事项1．菌种在保藏前所处的状态一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。2．菌种保藏所用的基质碳源、砂土、保护剂3．操作过程对细胞结构的损害冻结速度48/92四、菌种的鉴定49/921、菌种鉴定技术对细菌各种生物学性状进行分类，选用多项生理、生化指标逐一进行比较，通过查表或计算机分析各菌间相似度，完成细菌分类。细胞形状、菌落形态、G氏染色等形态学特征初步判定。遗传特征：核酸序列蛋白质比较核酸碱基组成50/9251/92用于鉴定的形态学特征52/92用于鉴定的生理生化特征53/92用于鉴定的遗传学特征细菌酵母菌霉菌54/922、细菌的鉴定55/92分离纯化得到单菌落菌落形态检验DNA提取构建系统发育树分子生物学鉴定通用引物扩增细菌16SrDNA序列16SrDNA序列分析鉴定结论样品接收革兰氏染色形态鉴定生理生化鉴定细菌鉴定仪细菌的鉴定流程图56/92形态学--革兰氏染色细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法能将细菌分为G+菌和G-菌。原理：由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁较多易被乙醇溶解的类脂质、肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。57/92G+菌和G-菌细胞壁结构和成分比较类型革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌强度较坚韧较疏松厚度厚，20～80nm薄，5～10nm肽聚糖层数多，15~50层，每层厚1nm少，1～3层肽聚糖含量多，可占胞壁干重50～80%少，占胞壁干重10～20%磷壁酸+-外膜-+结构三维空间（立体结构）二维空间（平面结构）58/92革兰氏染色步骤59/92革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌60/92•革兰氏阳性球菌：•产品样本、水、环境监测中发现的大多数阳性球菌来自人，有些可能来源于天然来源的原料。•药品生产中包括无菌工艺，最常见的污染物是革兰氏阳性球菌，有葡萄球菌属、微球菌属、链球菌属。•人源污染的细菌经常与不规范的无菌行为和操作、裸露的皮肤或头发(人类脱落)有关。常见革兰氏菌污染来源61/92•革兰氏阳性杆菌•污染物通常来自于环境，特别是土壤或尘埃，也会来自原料，如聚乙二醇(PEG)。•生物工艺最常见的革兰氏阳性杆菌污染，是芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属，它们产生的内生芽孢对环境压力有高耐受性。•芽孢杆菌属污染与缺乏无菌操作意识，材料和表面的消毒不彻底，无效SIP循环，违反无菌原则，以及污染的原料有关。常见革兰氏菌污染来源62/92•革兰氏阴性杆菌•污染通常来自水源、土壤、植被、原料。•革兰氏阴性杆菌包括大肠杆菌属，假单胞菌属，伯霍尔德杆菌属，劳尔氏菌属、狭