制药专业生化实验指导书

《生物化学》实验指导书适用专业:制药工程生物与食品工程学院生物科学系生物化学实验细则为了保证生物化学实验的顺利进行，培养同学们掌握良好、规范的生物化学基本实验技能，特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。1.实验前应提前预习实验指导书并复习相关知识。2.严格按照生物化学实验分组，分批进入实验室，不得迟到。非本实验组的同学不准进入实验室。3.进入实验室必须穿实验服。各位同学进入各自实验小组实验台后，保持安静，不得大声喧哗和嬉戏，不得无故离开本实验台随便走动。绝对禁止用实验仪器或药物开玩笑。4.实验中应保持实验台的整洁，废液倒入废液桶中，用过的滤纸放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。5.实验中要注意节约药品与试剂，爱护仪器，使用前应了解使用方法，使用时要严格遵守操作规程，不得擅自移动实验仪器。否则，因非实验性损坏，由损坏者赔还。6.使用水、火、电时，要做到人在使用，人走关水、断电、熄火。7.做完实验要清洗仪器、器皿，并放回原位，擦净桌面。8.实验后，要及时完成实验报告。实验一蛋白质的沉淀、变性反应（4学时）目的要求1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。3.了解蛋白质变性与沉淀的关系。原理在水溶液中，蛋白质分子表面形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。这种反应可分为以下两种类型：1．可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。2．不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。试剂和器材一、试剂1.蛋白质溶液：10ml/组取5ml鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤，新鲜配置。2.蛋白质氯化钠溶液：3ml/组取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。3.其余试剂：硫酸铵粉末（10克/组），饱和硫酸铵溶液(150ml)，3%硝酸银（280ml），0.5%乙酸铅（200ml），浓硫酸（5ml/组），5%磺基水杨酸（100ml），0.1%硫酸铜（100ml），饱和硫酸铜溶液（400ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），饱和氯化钠溶液（25ml），10%氢氧化钠溶液（500ml）。二、器材试管（15支/组），过滤漏斗（1个），试管架1个/组，玻璃棒1支/组，沸水浴4台，量筒（总需要20ml×1,200ml×1），烧杯（总需要100ml×2，400×2），试剂瓶（12个/组，附胶头滴管10支/组），移液管（5ml×6/组，1ml×3/组），滤纸1盒，洗瓶1个/组，废液缸1个/组，药匙1个/组，移液管架1个/组操作方法一、蛋白质的可逆沉淀反应—蛋白质的盐析作用(分级盐析)3ml饱和硫酸铵过滤滤液球蛋白沉淀硫酸铵粉末搅拌至饱和静置混匀静置10min3ml蛋白质氯化钠溶液滤液清蛋白沉淀弃去清液水观察现象二、蛋白质的不可逆沉淀反应1.重金属沉淀蛋白质2.酸沉淀蛋白质1）2）10滴浓硫酸6滴蛋白质溶液观察两液界面不要摇动摇动试管观察现象3.加热沉淀蛋白质取5支试管，编号，按下表加入有关试剂（单位/滴）。蛋白质溶液0.1%乙酸10%乙酸饱和氯化钠10%氢氧化钠蒸馏水123101010—5———5——————722试剂管号451010——5—2——2—5将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min，比较各管的沉淀情况。思考题1.名词解释：水化层；双电层；蛋白质变性；盐溶与盐析；蛋白质等电点沉淀。2.将实验结果写在实验报告中操作方法的对应位置上并就实验现象作简要解释。3.根据实验现象，讨论下列问题：1）蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？2）简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。4.作为杀菌剂，氯化汞是怎样起作用的？实验二DNA的琼脂糖凝胶电泳（4学时）目的要求1.掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。2.学习利用琼脂糖电泳方法测定DNA片段大小。3.学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。原理DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。琼脂糖凝胶电泳对DNA的分离作用主要依据DNA的分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离DNA片段大小范围见表1。因而要有效分离大小不同的DNA片段，主要是选用适当的琼脂糖凝胶浓度。不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的DNA移动速度次序如下：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。在同一浓度的凝胶中，分子量较小的DNA片段比较大的片段快。DNA片段的迁移距离（迁移率）与它的大小（分子量）的对数成反比。将未知DNA的迁移距离与已知分子大小的DNA标准物的电泳迁移距离进行比较，即可计算出未知DNA片段的大小。琼脂糖凝胶浓度/%可分辨的线性DNA大小范围/kb0.360—50.620—10.710—0.80.97—0.51.26—0.41.54—0.22.03—0.1表2-1DNA大小范围与琼脂糖凝胶浓度的关系本实验采用限制性内切酶HindⅢ或EcoRⅠ酶解λDNA的片段为标准物，建立其酶切图谱，同时以酶解各片段的分子量为纵坐标，以它们对应的迁移率为横坐标，在半对数坐标纸上，连接各点绘制出测定DNA分子量的标准曲线。共价闭环质粒pBR322DNA只有一个EcoRⅠ酶切位点，酶解后成为一条线状DNA，通过琼脂糖凝胶电泳，测量酶解后线型DNA的迁移距离，可以直接在分子量标准曲线上得出其分子大小。试剂和器材一、试剂1.限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ试剂盒2.标准λDNA：按使用说明配制3.标准pBR322：按使用说明配制4.酶反应终止液（10×0.1mol/LEDTA，20%Ficoll，0.25%溴酚蓝）：10μL/组称取3.72克EDTA·Na2·2H2O，20克Ficoll，0.25克溴酚蓝，溶解后定容至100ml。5.电极缓冲液（5×TBE）：用前稀释10倍称取10.88克Tris，5.52克硼酸，0.74克EDTA·Na2·2H2O，溶解后用蒸馏水定容至200ml。使用前用蒸馏水稀释10倍，称为TBE稀释缓冲液（0.5×TBE）。6.溴乙锭（EB）染色贮存液（1mg/ml）：1滴/组将100mg溴乙锭溶于蒸馏水或电极缓冲液100ml，棕色瓶内封好，避光保存。EB是诱变剂，配制和使用时应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在地面或桌面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。7.1%琼脂糖二、器材Eppendorf离心管（1.5ml，预先高温高压灭毒，3个/组）及其离心管架，电泳槽（1个/组），电泳仪（1个/2组），凝胶塑料托盘（1个/组），锥形瓶（100ml×1，烘干），小烧杯（50，100，250ml），微量注射器（2μL×3，15μL或20μL×1），一次性塑料手套(64只)，胶头滴管（×3），紫外反射投射仪，防护眼镜，洗瓶2个（分别盛重蒸水和蒸馏水），大烧杯1个，胶头滴管2支，量筒（50ml×1），卡尺（学生自备）操作方法一、DNA的酶解取2只清洁、干燥、无菌的Eppendorf管，编号，按照限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ试剂盒说明书用量，用微量注射器加入各种试剂\质粒λDNA和pBR322，最后用双蒸水补足至20μL，小心混匀。37℃水浴保温1—2h，然后各小管内加入2μL的酶反应终止液，混匀，终止酶促反应，冰箱内保存备用。操作前各试剂用量要反复核对，保证准确无误，所加试剂用量很少，必须认真操作。二、1.0%琼脂糖凝胶板的制备1.用配套挡板将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或水平工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进托盘长边上的凹槽内（距一端约1.5cm），梳齿底边与托盘表面保持0.5—1mm的间隙，安置好后保持静置状态。图2-1凝胶托盘的组装1.托盘2.挡板3.梳子2.称取0.3克琼脂糖置于小锥形瓶中，加入30mlTBE稀释缓冲液，在电炉上（或微波炉中）加热融化，轻轻摇匀，避免产生泡沫。3.待琼脂糖冷却至放在手背不觉太烫手（约60℃）后，滴一滴EB，然后将琼脂糖溶液在靠近挡板一侧连续地倒入托盘内（注意中间不要间断），使凝胶缓慢而连续地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层（7.1×9.0cm）。胶内不要存有气泡，室温下静置约20分钟。4.待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加入少量TBE稀释液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。5.取下封边的挡板，将凝胶连同托盘放入电泳槽平台上，倒入大量TBE稀释缓冲液直至浸没过凝胶面2—3mm，要防止样品槽内窝存气泡，可以用微量注射器挑除。三、加样用微量注射器或移液枪将经酶切的样品液和未经酶切的样品液（要加2μL的酶反应终止液）分别加入到胶板的不同加样槽内，每个槽（5×2×2.5mm）容积约为25μL，因此加样量不要超过20μL，避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。加样时，注射器针头穿过缓冲液小心靠近加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内，让其集中沉于槽底部。加完一个样品后的微量注射器应反复洗净后才能用以加下一个样品。四、电泳加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防止样品扩散，样品进胶后，应控制电压降不高于5V/cm。当染料带移动到距离凝胶前沿约1cm时，停止电泳。五、观察小心地取出凝胶置托盘上，将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长245nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光，可观察到清晰的条带。观察时应带上防护眼镜，避免紫外灯对眼睛的伤害。λDNA—HindⅢ酶解各片段大小见表2-2。片段碱基对数目（kb）道尔顿（×106）1234567823.1309.4196.5574.3712.3222.0280.5640.12515.06.124.262.841.511.320.370.08表2-2λDNA—HindⅢ酶解片段注意事项1.溴乙锭（EB）是诱变剂，配制和使用时应带乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地面上。凡是沾污过EB的器皿或物品，必须经过专门处理后，才能进行清洗或弃去。2.DNA酶解过程中，使用的器具都应干净，并经消毒。配制时急需用灭菌的双蒸水，还要防止限制性内切酶被污染。3.加样量的多少取决于加样槽最大容积。可以采用大小不同的样品槽模板以形成容积不同的加样槽，加入样品的体积应略小于加样槽容积，为此，对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。4.λDNA—HindⅢ酶解后应有8条带，但实际上只能看见6条，分子量小的2条带由于其荧光弱，往往