六六六微生物降解途径的研究进展-1

1六六六微生物降解途径的研究进展1曹礼张浩黄科谷涛洪青*李顺鹏2(南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物重点实验室南京210095)34摘要：六六六是一种曾在世界范围内广泛应用的有机氯杀虫剂，具有高毒性和长残留性,在发达5国家被限制或禁止使用，但是一些发展中国家和地区仍然被继续使用。即使在一些停用六六六多6年的国家，六六六的残留依然存在。本文概述了六六六的各同分异构体的结构、六六六降解菌的7多样性和六六六四种主要同分异构体（α-、β-、γ-、δ-HCH）的微生物降解的最新研究8进展，为六六六污染地区进行经济可行的生物修复提供参考。9关键词：六六六；降解途径；lin基因；高残留10Advancesinmicrobialdegradationpathwayof11hexachlorocyclohexane12CaoLiZhangHaoHuangKeGuTaoHongQing*LiShunpeng13(DepartmentofMicrobiology,KeyLabofAgriculturalEnvironmentalMicrobiology,MinistryofAgriculture,14CollegeofLifeSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095)15Abstract：Hexachlorocyclohexane(HCH)isanotorioushalogenatedorganicinsecticide，whichwas16onceusedwidelythroughouttheworldforagriculturalandpublichealthpurposes.17Hexachlorocyclohexane(HCH)isabroadspectruminsecticidestillusedasacheapbuteffective18insecticideinsomeofthedevelopingcountries,thoughdevelopedcountrieshavebannedorcurtailed19itsusebecauseofitshightoxicityandrecalcitrantpersistenceintheenvironment.Eveninthose20countrieswheretheuseofHCHhasbeendiscontinuedforanumberofyears,theproblemofresidues21ofallisomersofHCHremainsbecauseofitspersistence.Inthisarticle,wesummarizedthe22configurationofHCH-isomers，thediversityofmicroorganismsdegradingHCH，thecurrentprogress23regardingmainlyfourHCH-isomers（α-,β-,γ-andδ-HCH）biodegradationpathway.24Keywords:Hexachlorocyclohexane；Degradationpathway；lingenes；Highpersistence2526基金项目：国家自然科学基金项目(No.31070099);27*通讯作者：洪青，Tel:[phone],E-mail:[e-mail]28作者简介：曹礼(1977-)，男，安徽阜阳人，博士研究生，研究方向为环境微生物学与环境工程。E-mail:[e-mail]302六六六又名六氯环己烷（hexachlorocyclohexane，HCH），是一种有机氯杀虫剂，在上个1世纪七十年代前在世界范围内被广泛使用[1-5]。六六六在环境中的自然降解缓慢，在环境中2的半衰期长达几十年，甚至上百年，所以六六六的三种异构体(α-,β–和γ-HCH)于2010年被3联合国环境规划署（UnitedNationsEnvironmentProgramme，简称UNEP）列入持久性有机污4染物(persistentorganicpollutants，简称POPs)名单[6]。5在工业上，六六六通过苯和氯气在紫外线照射下合成而得，它是一种含有各种异构6体的混合物，被称为工业级六六六[3]。工业级六六六理论上有8种同分异构体，图1为α-、7β-、γ-、δ-、ε-、η-和θ-HCH的结构，这些异构体由于氯原子在环己烷环上不同的空间8排列而有不同的性质[7]。但是我们通常所说的六六六异构体一般包括五种异构体，即9α-HCH(60–70%),β-HCH(5–12%),γ-HCH(10–12%)，δ-HCH(6–10%)和ε-HCH10–4%)[6]，其他三种异构体因为含量极少又不重要，一般不包括在所谓的六六六总量内。1112图1六六六七种主要的异构体的氯原子在环己烷环上的空间排列13FIG.1Axialversusequatorialarrangementsofchlorineatomsinthefivemajorisomersof14HCHplusthelesscommonη-andθ-isomers.Notethata-HCHalsoexistsintwoenantiomeric15(＋and－)forms.16六六六的广谱毒性和长残留性引起世界范围内广泛关注。Weber等[5]科学家在2008年17估计，全世界共合成了400~600万吨六六六释放到环境中，在规模上相当于其它所有18持续性有机污染物（POPs）释放数量的总和。据报道，六六六异构体的残留在世界许多19国家的空气、水、土壤、食物、牛奶、鱼类和哺乳动物中被检出，甚至人的血液和脂肪组织203中，也有六六六残留[8-9]。即使一些远离六六六生产和使用基地，甚至从来没有生产和使用1过六六六的地方，诸如北极、南极和太平洋的环境中也被检测出有六六六的残留[8-9]。虽然2六六六已经在很多国家和地区被限制生产和使用，但是在印度和一些热带国家与地区，六六3六仍然在生产使用[6]，所以它在全世界的残留污染问题依然存在。4在六六六微生物降解途径的研究方面，主要的四种异构体均取得了不同程度的进展。其5中γ-HCH与α-HCH的微生物降解途径已被阐明，β-HCH和δ-HCH微生物降解的研究是目前环6境微生物研究领域的热点，而ε-HCH的微生物降解途径研究较少而未见报道。71降解六六六的微生物8通过微生物对六六六污染环境进行生物修复一直是世界各国环境工作者关注的焦点。通9过富集培养分离出许多能够降解HCH的微生物,包括细菌、真菌等[4，10]。第一株被报道的好10氧六六六降解菌是在十九世纪八十年代由日本科学家分离获得，然后其它国家也陆续11有相关菌株的报道和研究。ε-HCH的微生物降解研究较少，其降解微生物和降解途径12未见报道。目前好氧降解菌虽然来自全球不同，但大多数集中在Sphingobium。第一株13被报道的好氧降解菌是在十九世纪八十年代由日本科学家分离获得，然后其它国家也14陆续开展研究。目前大部分对六六六降解的研究主要集中在30个菌株中的三株[4]:从15日本分离到的SphingobiumjaponicumUT26[11]，从法国分离到的SphingobiumfrancenseSp+[12]16和从印度分离到的SphingobiumindicumB90A[13]（最初将这三株菌株均鉴定为Sphingomonas17paucimobilis，直到2005年才将它们重新鉴定为Sphingobium属的三个新种[14]）。其它六六六18的降解菌，分别分离筛选于德国、西班牙、中国、日本和印度等被六六六污染的土壤19中[4]，这些六六六的降解菌，在六六六降解的早期阶段有不同的底物特异性。国内报20道的六六六菌株主要有BI菌株[15]和Sphingomonassp.BHC-A菌株[16]。212六六六的厌氧微生物降解途径的研究进展22有关六六六的厌氧降解的报道始于十九世纪六十年代，随后厌氧降解六六六各种异构体23的微生物也陆续被发现[4，10]，最初认为六六六的生物降解主要是一种厌氧的过程，并且α、24β、γ和δ异构体的六六六的生物降解也被发现，由于ε异构体的六六六在环境中相对25而言最不稳定，至今仍没有报道ε异构体的六六六的厌氧降解。在六六六厌氧降解途26径中，不同的异构体通过一系列厌氧反应最终生成苯或氯苯[17-19]（如图2）。目前已有报道27苯的厌氧矿化[20-21]，虽然苯和氯苯在好氧条件下很容易被矿化，但是氯苯的厌氧矿化依然未28见报道。据我们所知，没有任何厌氧降解六六六的相关基因和酶被报道。而好氧降解六六六29的相关基因（lin基因）已经被分离并成功异源表达，并逐渐引起政府部门、企业和科研机304构的关注，以发展生物修复技术去改造被六六六污染的地区。12图2β-和γ-HCH厌氧代谢途径3FIG.2Consensusanaerobicdegradationpathwayofβ-andγ-HCH.Notethattwo4intermediatesthathavebeenproposedbutnotyetobservedempiricallyareshowninsquare5brackets.ThestructuresofTCCHandDCCHareshownintheplanarformatbecausetheir6stereochemistrieshavenotbeenestablished.783γ-和α-六六六的好氧微生物降解途径的研究进展9γ-HCH降解途径及其相关基因的研究是上世纪九十年代以来微生物降解研究的热点。日10本学者通过近十五年的努力首先从SphingobiumjaponicumUT26克隆到了16个与γ-HCH降11解直接相关基因，在2005年提出了一条完整的γ-HCH降解途径[22-23]。如图3，脱氯化氢酶12基因（linA）；1,4-TCDN脱氯酶基因（linB）；2,5-DDOL脱氢酶基因（linC）和2,5-DDOL13脱氢酶基因linX组成了γ-HCH生物降解的上游阶段。调节基因（linR）；2,5-DCHQ还原性14脱氯酶基因（linD）；氯代对苯二酚1,2双加氧酶基因（linE）和MA还原酶基因（linF）组15成了γ-HCH生物降解的下游阶段[23]。LinE和LinEb都有催化CHQ生成2,6-DCHQ的活性，16但是LinE和LinEb在UT26中主要参与CHQ到2,6-CHQ的反应[24]。编码琥珀酰辅酶A:3-17羰基己二酸辅酶A转移酶基因（linGH）、β-酮己二酸硫解酶基因（linJ）以及参与linGH基18因表达的调节基因linI虽然也已经被鉴定，但是其表达类型待定[23]。19在六六的上游代谢途径中，有三个代谢产物，即2,5-DCHQ、1,2,4-TCB和2,5-DCP，20只有2,5-DCHQ可以在下游代谢途径中进一步被转化，而1,2,4-TCB和2,5-DCP不能被21SphingobiumjaponicumUT26进一步降解，称为末端死产物。另外，Sphingobiumjaponicum22UT26中的脱氯化氢酶（LinA）；1,4-TCDN脱氯酶（LinB）定位在细胞的周质空间[25]，而两23个末端死产物1,2,4-TCB和2,5-DCP在细胞的周质空间一旦产生，将对Sphingobium24japonicumUT26细胞有毒害作用[26]。现在已经证明，在UT26中有四个基因（linKLMN）编255码的ABC转运系统作为一个疏水性物质尤其对2,5-DCP的转运泵来解除这种毒害[27]。1SphingobiumindicumB90A和Sphingomonassp.BHC-A中也存在类似Sphingobium2paucimobilis