冬凌草中冬凌草甲素乙素的研究进展

冬凌草中冬凌草甲素、乙素抗肿瘤药效研究进展冬凌草又名冰凌草、六月令，得名于冬天全株结满薄如蝉翼的银白色冰凌片。冬凌草为唇形科香茶菜属植物碎米桠Rabdosiarubescens(Hems.l)Hara的地上草质部分,产于我国河南、山西、四川、贵州等地。冬凌草味苦,性微寒,，有广泛的生物活性，具有抗炎、降压、清热解毒、消炎止痛、健胃活血等多种药理作用。河南民间用于治疗咽喉肿痛、食管癌等已有五十余年历史,临床报道其水及醇提取物对食管癌、贲门癌、肝癌、乳腺癌有一定疗效[1]。近年来的药理研究充分证明,冬凌草有良好的消炎、抗菌、镇痛作用,可有效地抑制甲型、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等,从而提高机体的抵抗力,研究证明二帖类中的冬凌草甲素和冬凌草乙素是抗肿瘤的有效成分[2]。由于该植物及其主要活性成分良好的抗肿瘤作用和它们在毒性实验中显示的无明显毒性，冬凌草引起了国内外医药界学者的广泛关注。近30年来，国内外学者对冬凌草及其同属植物进行了多方面的研究。1．冬凌草的化学成分冬凌草中的主要成分是贝壳杉烷二萜类化合物。现已从各产地冬凌草中分得20多个的此类化合物，主要为母核对映贝壳杉烯和螺断贝壳杉烯结构。从冬凌草中分得三萜、甾体类成分α-香树脂醇、β-谷甾醇、2α-羟基乌索酸、β-胡萝卜甙、熊果酸等。研究表明，从冬凌草茎叶精油中已分离鉴定了α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、1，8-桉叶素、对-聚伞花素、壬醛、癸醛、β-榄香烯、棕榈酸、线蓟素、胡麻素和水杨酸。冬凌草甲素、乙素是唇形科(Labiatae)香茶菜属(Rabdosia)植物中的2种重要活性二萜成分。1.1冬凌草甲素冬凌草甲素分子式：C20H28O6，熔点248℃-250℃，微溶于水，溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮等。冬凌草甲素对多种癌细胞具有很强的杀灭抑制作用，主要用于抗癌，抗菌、抗肿瘤、杀虫清热解毒、消炎止痛、健胃活血及等作用冬凌草甲素结构示意图1.2冬凌草乙素冬凌草乙素C20H2606是从中草药冬凌草中提取出来的具有抗癌活性的天然有机物，为中成药冬凌草片和冬凌草糖浆的有效成分，其结式如图1所示，从图中可知，分子中存在1个a一亚基环戊酮结构，即A环区。这种结构具有较大的内应力，是一个抗癌活性区。2冬凌草的药理作用2.1抗菌消炎作用冬凌草对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、乙型链球菌均有小剂量抑菌，大剂量杀菌作用，其中肺炎双球菌对之最敏感。另外，冬凌草醇提物对大鼠棉球肉芽肿有抑制作用，对小鼠有镇痛作用。2.2抗氧化作用选取羟自由基，超氧阴离子自由基，一氧化氮和谷胱甘肽作研究指标，观察冬凌草甲素(Ori)、冬凌草乙素(Pon)清除自由基的能力及肝细胞保护作用，研究发现Ori可有效的清除羟自由基。[3、4]3抗肿瘤作用3冬凌草甲素的抗肿瘤作用3．1抗白血病Ikezoe等[4]研究发现，冬凌草甲素抑制多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病和成人型T细胞白血病细胞的生长。缺口末端标注技术(TUNEL)显示，冬凌草甲素以时间依赖性引起白血病MT一1细胞凋亡。冬凌草甲素下调Bcl-2家族的Mcl一1和BCL—xL水平，但不能下调MT．1和骨髓瘤RPMl8226细胞中的Bcl一2蛋白。进一步研究发现，冬凌草甲素在这些细胞中抑制了转录因子NF．1cB与靶DNA区段的结合活性。冬凌草甲素还能抑制造血系细胞Jurkat、巨噬细胞RAW264．7细胞中由TNF．α和LPS刺激诱导产生的NF一xB活性。但冬凌草甲素不影响健康志愿者的正常淋巴细胞存活率。Liu等[5]研究了冬凌草甲素体外对白血病HPB—ALL细胞株抗增殖和凋亡诱导作用及其机制。结果显示，冬凌草甲素能以时间、剂量依赖方式显著抑制HPB．ALL细胞增殖并促使其凋亡。在给予冬凌草甲素48h后，伴有凋亡细胞的标志性变化，线粒体膜电势(△Vm)破裂的百分数以剂量依赖方式逐渐增加，在给予冬凌草甲素72h后，坏死细胞显著增加。给予冬凌草甲素24h后，这些细胞的Bcl-2和Bcl—xl蛋白表达显著下调，而促凋亡蛋白Bax和Bid表达上调。3．2抗鼻咽癌、肺癌朱国臣等[6]发现，冬凌草甲素能抑制人鼻咽癌CNE一2细胞生长，诱导其凋亡并坏死，流式细胞分析发现“亚二倍体峰”，冬凌草甲素作用后CNE-2细胞处在G2／M期的比例增多。此外，他们研究了冬凌草甲素的放射增敏比。Liu等[7]的研究发现，冬凌草甲素(28umol·L-1)能抑制肺癌SPC—A-1细胞增殖并诱导凋亡。观察到凋亡细胞的形态明显变化，特别是用冬凌草甲素处理48～60h的细胞48h后，蛋白印迹法分析显示bcl．2表达下调而bax蛋白表达上调。3．3抗肝癌、胆囊癌Zhang等[8]在体外培养基中给予肝癌BEL-7402细胞不同浓度的冬凌草甲素后，发现冬凌草甲素能以时间、剂量依赖方式抑制BEL一7402细胞增殖并引起细胞显著凋亡。细胞接触冬凌草甲素60h后，观察到凋亡细胞的形态明显变化I蛋白质印迹法显示，caspase．3酶原蛋白(32x103)分裂出现20×103的亚单位，细胞凋亡过程中，观察到Bcl一2蛋白表达下调而Bax蛋白表达上调。不同浓度的冬凌草甲素处理人胆囊癌GBC—SD细胞，能诱导细胞凋亡，并呈浓度依赖性。药物作用24h后，对照组和实验组细胞中p53，bcl一2，fas／apo-1及c—myc蛋白表达差异均有统计学意义(P0．05)[9]。3．4抗黑色素瘤、皮肤癌Ren等[10]叫研究发现，冬凌草甲素以时间剂量依赖方式抑制培养的鼠黑色素瘤K1735M2细胞的生长。进一步研究表明，其抑制效应与剂量依赖的G，／M相停止和分化诱导有关。形态学观察显示，冬凌草甲素能诱导K1735M2细胞产生树突状结构。迁移结果表明，冬凌草甲素以剂量依赖方式影响K1735M2细胞的活力。Li等[11]给予人皮肤癌A431细胞不同剂量的冬凌草甲素24h后，发现冬凌草甲素X于A431细胞酪氨酸激酶活性有一定的抑制能力。酪氨酸激酶活性降低和EGFR酪氨酸磷酸化阻断可能是冬凌草甲素诱导A43l细胞坏死的一个原因。3．5抗宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌等崔侨等[12]等发现，冬凌草甲素明显抑制宫颈癌HeLa细胞增殖，诱导其凋亡并发生自噬。冬凌草甲素作用24h后，促凋亡蛋白Bax、细胞色素c和控制Bax活力的去乙酰化酶SIRT一1的表达明显改变。冬凌草甲素(64umol／L)诱导的自噬通过影响SIRT．1和线粒体途径蛋白表达下调凋亡。Chen等[13]研究了冬凌草甲素对人前列腺癌(DU-145，LNCaP)、乳腺癌(MCF一7)和卵巢癌(A2780和PTXl0)细胞生物活性的影响。冬凌草甲素对所有被测定的癌细胞都有抗增殖活性，IC。在5．8±2．3～11．72土4．8“mol／L范围。更值得注意的是，冬凌草甲素诱导癌细胞凋亡的浓度不能诱导培养的正常人成纤维细胞凋亡。3．6其他Liu等[14]研究发现，当鼠脾淋巴细胞和冬凌草甲素一起培养时，冬凌草甲素有效地以剂量、时间依赖方式抑制刀豆蛋白ConA刺激的细胞过度增殖。抑制活性主要是干涉DNA复制和调节了细胞周期所致，CD4+、CD8+淋巴细胞水平降低也起了作用。二甲苯诱导的鼠耳肿胀模型结果表明，冬凌草甲素降低了鼠耳肿胀程度和动物血清中IL．2水平。ELISA测定结果表明，冬凌草甲素能抑制鼠脾淋巴细胞分泌IL-2，IFN-γ，IL-12p40和TNF．α的能力，而且逆转录PCR的结果证明，抑制是通过降低这些细胞因子mRNA表达水平实现的。MTT法测定显示，冬凌草甲素以时间、剂量依赖方式抑制人结直肠癌HT29细胞的增殖。体内实验表明，HT29细胞在小鼠体内培育24h后，腹腔注射冬凌草甲素(10，l5，20mg／kg体重，1～12d)也观察到实体瘤受抑制[15]。Jin等[16]的研究结果显示，冬凌草甲素以浓度、时间依赖方式抑制骨肉瘤细胞U2-OS，MG一63和SaOS一2增殖并诱导凋亡。冬凌草甲素能够诱导细胞色素释放，并伴随CasPase一9，caspase一3，PARP激活。4.冬凌草乙素的抗肿瘤作用Liu等[17]的研究结果显示，冬凌草乙素能以时间、剂量方式显著抑制人骨髓瘤细胞系K562和HL·60细胞的增殖并诱导凋亡。用冬凌草乙素处理细胞48—72h后，可以清楚地观察到细胞凋亡。凋亡发生时，caspase．3酶原蛋白(32×103)分裂出17×103亚单位，同时相对分子质量为116×103的PARP分裂产生89×103组分。冬凌草乙素处理细胞24～48h后，Bcl．2表达下调而Bax表达上调。Zhang等[18]研究发现冬凌草乙素显著抑制人肝癌细胞系QGY一7701和HepG一2细胞增殖并诱导凋亡，其机制是Survivin和Bcl-2表达下调及Bax表达上调。5.冬凌草甲素和乙素抗肿瘤作用的比较Zhang等[19]评价了体外冬凌草甲素和冬凌草乙素对癌细胞和人外周血单个核细胞(PBMC)的抗增殖活性。冬凌草甲素比冬凌草乙素对4种癌细胞(人黑色素瘤A375一s2、人子宫癌HeLa、人乳腺癌MCF一7、鼠纤维肉瘤L929)有更强的细胞毒作用。冬凌草甲素只寸A375．S2细胞比对另外几种细胞有更强的增殖抑制活性。用冬凌草甲素34．3肛mol／L处理12h后，能显著抑制A375一S2细胞增殖，而对PBMC的作用较弱。而冬凌草乙素在相同条件下能显著抑制PBMC的生长。A375．S2细胞分别用冬凌草甲素34．3¨mol／L和137．4“mol／L处理后显示冬凌草甲素诱导A375．S2细胞死亡是凋亡和坏死的平衡。Hsieh等1201测定了冬凌草乙素和冬凌草甲素对低侵袭性乳腺癌M细胞系MCF一7和高侵袭性乳腺癌细胞系MDA—MB-231细胞及正常乳腺细胞系MCF一10A细胞的作用，发现冬凌草乙素比冬凌草甲素能更有效地抑制MCF．7细胞集落的生成和增殖，但用于MCF—IOA细胞则观察到相反的结果。在对MCF一7或MCF—IOA细胞都有效的剂量范围内，它们都不影响MDA—MB-23l细胞的增殖。冬凌草乙素处理MCF．7细胞，发现cyclin．B1，cdc2转录因子E2F和780位Ser磷酸化的Rb表达水平均降低。而冬凌草甲素处理则无明显的作用。二者都不能改变MCF·7细胞的cyclin-D1和cdk4的表达。对于MCF-10A细胞，冬凌草甲素比冬凌草乙素能更有效地抑制cyclin—B1，cdc2转录因子E2F和780位Ser磷酸化的表达。进一步研究表明，冬凌草甲素处理MCF．10A细胞后，其NF—lcB组分p65、p50及其上游调控子I．'cB减少，对MCF一7细胞则无这种作用。6.总结冬凌草甲素、乙素具有很好的抗癌活性，有着广阔的开发前景。目前，国内除了早期上市的冬凌草总提物制剂外，尚无冬凌草甲素、乙素的单体制剂。近年对冬凌草甲素的研究主要集中在生物活性上，在提取、分离、结构修饰、制剂及药动学等方面也作了很多有益的探讨；冬凌草乙素的研究近年也逐渐增多。近年的研究主要是冬凌草甲素，尤其是冬凌草甲素的抗肿瘤活性方面的实验报道较多。研究表明，冬凌草甲素具有较好的抗肿瘤活性，且对正常细胞毒性较低，具有很好的临床应用和开发价值。将冬凌草甲素开发成新药制剂，对开发利用丰富的自然资源具有重要的意义。参考文献[1]阴健.中药现代研究与临床应用[M].北京:学苑出版社,1995:223.[2]刘晨江,赵志鸿.冬凌草的研究进展[J].中国药学杂志,1998,33(10):577.[3]张春玲，吴力军，田代真一，等.冬凌草甲素通过激活caspase诱导HeLa细胞凋亡[J].中国药理学通报，2003，19(5)：521-525[4]张守伟，刘加军.复方冬凌草甲素对肺癌SPCA-1细胞的端粒酶活性的影响[J].临床肺科杂志，2003，8(3)：204-206[5]LiuJJ，HuangRW，LinDJ，a1．AntiproliferationeffectsoforidoninonHPB—ALLcellsanditsmechanismsofac．Tion[J]．AmJHematol,2006．81(2)：86—94．[6]朱国臣，