保护酶测定

植物保护酶活性测定1.CAT活性测定1.1试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：分别取A母液（Na2HPO4）457.5ml和B母液（NaH2PO4）292.5ml混匀即为1000ml；1.2反应混合液配制：取200mlPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml30%的H2O2摇匀备用。1.3样品测定取3ml反应液并加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD240（紫外）值（测定40s）。1.4酶活性计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=（ΔA240xVt）/（WxVsx0.01xt）(u/gmin)ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vt为提取酶液总体积（ml，（1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，0.1ml）。2MDA含量的测定2.1试剂配制：10%TCA：称取100g三氯乙酸定容至1000ml0.67%TBA：称取3.35g硫代巴比妥酸溶于500ml10%TCA（避光保存）2.2测定步骤：称取样品2g，加入2ml10%的三氯乙酸，研磨至匀浆，再加8ml三氯乙酸进一步研磨。匀浆在4000r/min离心10min，上清液为样品提取液。吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml0.6%硫代巴比妥酸溶液，混匀物沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别测定532nm、600nm、450nm波长下的吸光度。2.3计算组织中MDA含量：MDA浓度C（umol/L）=6.45x（OD532-OD600）-0.56xOD450MDA含量（umol/gFW）=CxV/W式中V为提取液体积（1.6ml），W为样品鲜重（0.2g）。4POD过氧化物酶活性测定4.1试剂配制：0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：分别取A母液（Na2HPO4）123ml和B母液（NaH2PO4）877ml混匀即为1000mlPBS（0.2M，pH6.0）；4.2反应混合液配制：取200mlPBS（0.2M，pH6.0），加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基分）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml30%的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。4.3样品测定取3ml反应液并加入30ul酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40s），（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）。4.4酶活性计算：以每minOD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。POD=（ΔA470xVt）/（WxVsx0.01xt）(u/gmin)ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vt为提取酶液总体积（ml，（1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。5.SOD超氧化物歧化酶活性测定5.1试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g；分别用蒸馏水定容至1000ml。0.05mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）配制：分别取A母液（Na2HPO4）228.75ml，B母液（NaH2PO4）21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。（3）30uMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。（4）60uM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mM氮蓝四唑（NBT）溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保存。酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清即为酶液。5.2酶活性测定（1）反应混合液配制：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml，混合摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30ul酶液与试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30ulPBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中，测定时用于调零。（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测560nm波长下的吸光度（出现颜色即可测定）。（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%所需酶量（测定样品值要在最大管的一半左右才合适，否则需要调整酶量）为1个酶活单位（u）。SOD总活性=[（Ack-AE）xV]/(1/2AckxWxVt)SOD比活力=SOD总活性/蛋白含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml，6ml，加入PBS的体积）；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。